СПОСОБНОСТЬ ЭМБРИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ СНИЖАТЬ ТЯЖЕСТЬ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ У КРЫС

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков

Загрязнение окружающей среды и ухудшение экологической обстановки привели к росту количества острых и хронических заболеваний печени. На современном этапе исследований этой проблемы разработаны различные методы лечения как традиционного, так и альтернативного характера [1—3].

Как известно, развитие острой и хронической патологии печени сопровождается изменением цитокинового профиля в печени. Активными участниками этого процесса являются как паренхиматозные, так и непаренхиматозные клетки печени, продуцирующие фактор некроза опухоли альфа (ФНО альфа), трансформирующий фактор роста бета (ТФР бета), интерлейкины 1 и 6 (ИЛ-1, ИЛ-6) и другие факторы воспаления и последующей регенерации органа [1, 4]. Показана возможность изменения цитокинового профиля и состояния реципиента при экспериментальной патологии печени путем экзогенного введения ростовых факторов [5]. Фетальные ткани характеризуются высоким содержанием цитокинов и ростовых факторов [6], что дает основание предположить перспективность применения их экстрактов для коррекции цитокинового профиля при поражении печени.

Классическая модель острого токсического гепатита при однократном введении тетрахлорметана (ТХМ) привлекает внимание исследователей разнонаправленностью действия ССl₄, приводящего к нарушению белоксинтезирующей функции, нарушению прооксидантно-антиоксидантного равновесия и гиперпродукции провоспалительных цитокинов [4, 7].

Целью работы было изучение влияния предварительного введения эмбриоспецифических факторов (ЭСФ) в виде цитозоля эмбриональных тканей человека 9—12 недель гестации на течение ТХМ-индуцированного гепатита.

Материалы и методы исследования

В работе использовали белых нелинейных крыс-самцов массой 150—200 г (n=36). Все процедуры с животными проводили под эфирным наркозом.

Острую интоксикацию моделировали однократным внутрибрюшинным введением 50%-го масляного раствора ТХМ в дозе 0,3 мл на 100 г массы тела. В качестве эмбриоспецифических факторов использовали цитозоль фетальных тканей человека 9—12 недель гестации, полученный в результате высокоскоростного центрифугирования 40%-го гомогената при 105000 g в течение 1,5 часов. Все работы по получению цитозоля проводили в стерильных условиях.

Животные были разделены на следующие группы: 1 — контрольная. Животным за 4 ч до интоксикации вводили в бедренную вену 0,3 мл/100 г физиологического раствора; 2 -опытная. Животным за 4 ч до индукции гепатита в бедренную вену вводили 0,3 мл/100 г цитозоля; 3 — интактные животные. Забор крови из хвостовой вены осуществляли через 24, 48 и 72 ч после введения ТХМ. В сыворотке крови определяли активности аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) с использованием стандартных наборов. Активность ферментов выражали в Е/л. Динамику накопления ТБК-активных продуктов определяли по методу [8], показатель выражали мкмоль МДА/л сыворотки. Изменение содержания альбумина определяли экспресс-методом по реакции взаимодействия с бромкрезоловым зеленым, выражали в г/л сыворотки.

После последнего забора крови животных декапитировали, печень перфузировали in situ физиологическим раствором и готовили 25%-ный гомогенат на 50 мM трис-HCl буфере, содержащем 50 mM NaCl. В гомогенате печени животных исследовали базальный уровень ТБК-активных продуктов согласно методу [8], показатель выражали в пмоль МДА/мг белка. Также исследовали интенсивность индуцированного перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для этого гомогенат инкубировали 10 мин в среде, содержащей 50 мM трис-НСl, 50 мM NaCl, 0,25 мM аскорбата и 12 мкM FeSO₄. Скорость накопления ТБК-активных продуктов определяли согласно методу [9] и выражали в пмоль МДА/мг белка за 1 мин. Активность каталазы определяли спектрофотометрически по убыли перекиси водорода при длине волны 240 нм [10]. Активность фермента выражали в мкмоль Н₂О₂/мг белка за 1 мин.

Содержание белка в гомогенате печени определяли биуретовым методом.

В работе использовали экспресс-наборы и реактивы фирм Sigma (USA), Reanal (Чехия), "Биокон"(Россия).

Статистическую обработку результатов производили при помощи компьютерного пакета программ Statistica v.5.5 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Достоверно различными считались результаты при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

В процессе моделирования экспериментального гепатита гибель в контрольной группе животных составила 30%, в опытных группах летальных исходов не наблюдалось.

Острая интоксикация крыс ТХМ вызывала значительное повышение амино-трансферазной активности в сыворотке крови. На 1 и 2 сут после введения ТХМ активность АСТ в контрольной группе повысилась в 15 и АЛТ в 21 раз по сравнению с интактной группой. Через 72 ч после индукции гепатита наблюдалась тенденция к снижению активности АСТ и достоверное по отношению ко 2 сут уменьшение активности АЛТ (рис. 1).

У животных 2 группы через 24 ч после введения ТХМ активность АСТ была ниже в 4,7 и АЛТ в 3,5 раза по сравнению с контролем. Через 48 ч эффект ЭСФ сохранялся на том же уровне. На 3 сут активность аминотрансфераз была в 5 раз ниже, чем в контрольной группе, и незначительно превышала нормальные значения (рис. 1).

У интактных животных содержание альбумина в сыворотке крови находилось в пределах 40—50 мг/л. Через 24 ч после введения ТХМ уровень альбумина составлял 28%, через 48 ч — 55% относительно интактного, к 3 сут показатель нормализовался. Введение цитозоля фетальных тканей человека приводило к достоверному повышению содержания альбумина в сыворотке крови как в первые (62%), так и во вторые сутки (75%) после введения ТХМ, через 72 ч показатель также полностью нормализовался (рис. 2б).

Как известно, одним из механизмов развития ТХМ-индуцированного повреждения печени является активация свободнорадикальных процессов. Накопление ТБК-активных продуктов в сыворотке является одним из показателей нарушения окислительно-восстановительного баланса в поврежденном органе. Острая интоксикация ТХМ приводила к повышению содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке животных. Через 24 ч после введения ССl₄ уровень МДА превышал интактный в 1,8, через 48 ч — в 2,2 и через 3-е сут — в 1,7 раза. При этом наблюдались достоверные отличия между 1 и 2, а также 2 и 3 сут эксперимента (рис. 2а).

Предварительное введение ЭСФ приводило к снижению уровня ТБК-активных продуктов в сыворотке. Через 24 и 48 ч содержание МДА было в 1,5 раза ниже, чем в контрольной группе, к 3 сут показатель полностью нормализовался (рис. 2а).

Учитывая, что вклад в развитие свободнорадикальных процессов могут вносить как клетки печени, так и клетки крови, было исследовано состояние прооксидантно-антиоксидантной системы печени через 72 ч после введения ТХМ. Установлено, что базальный уровень ТБК-активных продуктов в контрольной группе превышал интактный в 1,5 раза, интенсивность индуцированного ПОЛ была выше в 1,3 раза, а каталазная активность печени снижалась до 52%. Предварительное введение ЭСФ предотвратило изменения исследованных показателей (таблица).

Ранее нами было показано, что введение ЭСФ за 3 сут до острой интоксикации ТХМ не влияло на трансаминазную активность и снижало содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке крови только на первые сутки [3]. Результаты настоящей работы показывают, что сокращение срока введения ЭСФ до 4 ч приводит к выраженному снижению маркеров токсического повреждения печени и предотвращает нарушения в антиоксидантной системе печени.

Как известно, некротическая гибель клеток, наблюдаемая при интоксикации ТХМ, сопровождается нарушением целостности плазматических мембран, что приводит к потере внутриклеточных аминотрансфераз и активации свободно-радикальных процессов. Выраженное снижение трансаминазной активности и содержания ТБК-активных продуктов в соворотке крови отравленных животных, как показателей степени повреждения печени, наблюдаемое при введении ЭСФ, по-видимому, является свидетельством уменьшения количества погибших клеток. Можно предположить, что одним из механизмов превентивного действия ЭСФ является изменение физико-химических свойств мембран, повышающих резистентность к экстремальному воздействию.

Нарушение окислительно-восстановительного равновесия в клетках печени при острой интоксикации ТХМ обусловлено как взаимодействием между ядом и цитохромом Р-450 с образованием активных метаболитов ССl₄ в гепатоцитах, так и активацией непаренхиматозных клеток печени, сопровождающейся гиперпродукцией активных форм кислорода [1, 4, 7].

Согласно современным данным [1, 4], именно непаренхиматозные клетки печени вносят основной вклад в развитие острого поражения и последующую регенерацию органа. Активированные клетки печени продуцируют провоспалительные цитокины и большое количество перекиси водорода. Н₂О₂, в свою очередь, является одновременно мощным стимулятором свободнорадикальных процессов и фактором, регулирующим цитокиновый профиль в поврежденном органе. Выраженное положительное влияние ЭСФ на содержание ТБК-активных продуктов, интенсивность индуцированного ПОЛ и каталазную активность в печени, по-видимому, свидетельствует о модулирующем действии активных компонентов цитозоля фетальных тканей человека на цитокиновый профиль поврежденного органа. Существуют литературные данные о возможности восстановления цитокинового баланса, измененного с возрастом, путем введения фетальных экстрактов [11]. Эффекты экзогенных цитокинов и ростовых факторов опосредуются в клетке через различные регуляторные каскады при помощи как универсальных мессенджеров, так и факторов транскрипции, таких как NFkB, AP-1, которые являются важными компонентами системы регуляции окислительно-восстановительного равновесия [1, 4, 11]. Можно предположить, что нормализация каталазной активности может быть обусловлена действием ЭСФ на количество и стабильность мРНК фермента, либо на один из этапов его синтеза de novo.

Таким образом, предварительное введение ЭСФ предотвращает гибель и улучшает общее состояние отравленных животных. Изменения динамики трансаминазной активности, уровня ТБК-активных продуктов и содержания альбумина в сыворотке крови на всех этапах эксперимента свидетельствуют об эффективности профилактического применения ЭСФ при остром ТХМ-индуцированном гепатите. Кроме того ЭСФ способствует нормализации как неферментативного звена (базальный уровень ТБК-активных продуктов и интенсивность индуцированного ПОЛ), так и ферментативного (каталазная активность) через 3 сут после отравления.

Литература
1. Fausto N. Liver regeneration // Hepatology. —2000. —32(1). —P. 19—31.
2. Tresco P.A., Biran R., Noble M.D. Cellular transplants as sources for therapeutic agents // Adv. Drug Deliv. Rev. —2000. —42, N1—2. —P. 3—27.
3. Петренко А.Ю., Оченашко О.В. Влияние препаратов эмбриональных тканей человека на интенсивность ПОЛ при остром токсическом гепатите у крыс // Проблемы криобиологии. —2001. —№2. —C. 66—71.
4. Kaplowitz M.D. Biochemical and cellular mechanisms of toxic liver injury // Semin Liver Dis. —2002. —N4. —P. 137—144.
5. Zou Y., Gong D.Z., Mei M.H., Zhang W.Q. Protective effect of hepatocyte growth factor on hepatocyte poisoning by carbon tetrachloride and related gene expression in rats // Sheng Li Xue Bao. —2000. —52(1). —P. 59—63.
6. Sennikov S., Krysov S., Silkov A. Production of IL-10, TNF-alpha, IFN-gamma, TGF-beta1 by different populations of erythroid cells derived from human embryonal liver // Cytokine. —2002. —V. 17, №4. —P. 221—225.
7. Костюк В.А. Роль ковалентного связывания и ПОЛ в повреждении печени четырехлористым углеродом // Биохимия. —1991. —56, №10. —C. 1878—1885.
8. Андреева Л.Н. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб.дело. —1988. —№11. —С. 41—43.
9. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. —М.: Наука, 1972. —252 с.
10. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. —1988. —№1. —С. 16—19.
11. Gorczynski R.M., Bessler W.G., Chung S. et al. A fetal sheep liver extract reverses age-related increments in spontaneous and induced cytokine production by indirect environmental effects // Immunology Letters. —1998. —60, N2—3. —P. 157—164.

| Зміст |