УДК 577.11

Т.Л. Діброва, к.б.н., В.Є. Кривенчук, к.х.н., А.П. Никитенко, Н.Ф. Стародуб, д.б.н.

ТВЕРДОФАЗНИЙ КОНКУРЕНТНИЙ ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ ПЕСТИЦИДУ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИОЦТОВОЇ КИСЛОТИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ

Серед пестицидів великих масштабів досягло застосування арілоксиалкілкарбонових кислот, типовим представником яких є 2,4-діхлорфеноксиоцтова кислота (2,4-Д). Цей пестицид знищує дводольні бур'яни в посівах злакових культур. Разом з тим він токсичний для людей і тварин, оскільки викликає не тільки гострі і хронічні отруєння, але й має алергенну, мутагенну та онкогенну активність [1]. Забруднення їжі, води й інших об'єктів навколишнього середовища, що становить потенційну небезпеку, диктує потребу в простих, недорогих, швидких методах для виявлення цього пестициду в залишкових кількостях.

Традиційно для контролю концентрації різних пестицидів застосовують фізико-хімічні методи аналізу: газову, газорідинну і високоефективну рідинну хроматографію [2, 3]. Ці методи незамінні, коли необхідно точно ідентифікувати речовину. Однак, вони мають ряд істотних недоліків — трудомісткість, складність, тривалість аналізу, необхідність використання дорогого устаткування і залучення висококваліфікованого персоналу.

Одержання специфічних антитіл при імунізації кон'югатами пестициду з білком поклало початок досліджень аналітичних можливостей імунохімічних методів, у тому числі й імуноферментного аналізу (ІФА). Розвиток цього напрямку відбувається як через пошук шляхів одержання різних типів антитіл, так і через створення різних методичних схем виконання ІФА, що дозволяють вимірювати вміст пестицидів у модельних та реальних системах [4—8]. Твердофазний ІФА як аналітичний метод по чутливості, специфічності, точності і відтворенню результатів не поступається газовій хроматографії і має явні переваги щодо простоти виконання і витратам.

Метою даної роботи було одержання поліклональних антитіл до 2,4-Д при використанні різних типів його кон'югатів бичачим сироватковим альбуміном, визначення можливого впливу структури кон'югата на його імуногенність, а також розробка на цій основі аналітичної схеми для визначення низьких рівнів вмісту гербіциду в водних розчинах на основі конкурентного твердофазногого ІФА.

Матеріали та методи дослідження

У роботі використовували 2,4-Д виробництва Уральського хімзаводу (Росія), повний ад'ювант Фрейнда, твін-20, ортофенілендіамін, кон'югат антикролячого IgG з пероксидазою хріна отримані від фірми "Sigma" (США). При синтезі кон'югатів пестициду з білком носіями слугували бичачий сироватковий альбумін (БСА), яєчний альбумін (ЯА) і пероксидаза з коренів хріну (ПХ з RZ=3,0) фірми "Sigma" (США).

Для кон'югування 2,4-Д з БСА по карбоксильній групі брали 10 мл 0,003 мМ водного розчину білка та готували 1 мл 0,1 мМ розчину 2,4-Д в диметилформаміді. Обидва розчини змішували і потім до суміші додавали водорозчинний карбодіімід (1-цикло-гексил-3-/1-N'-метилморфолиноэтил/-карбодіімід-п-толуолсульфонат) в кінцевій концентрації 0,24 мМ. Після цього суміш перемішували протягом 8 год при кімнатній температурі, а потім залишали її на 12 год у холодильнику. На завершення суміш діалізували проти дистильованої води, центрифугували і ліофільно висушували. Аналогічно одержували кон'югати 2,4-Д з ПХ в співвідношенні від 4:1 до 30:1 та з ЯА в співвідношенні 20:1 моль/моль.

Для кон'югування 2,4-Д з БСА по бензольному ядру готували розчин 0,1 мМ 2,4-Д в 2 мл дистильованої води з додаванням 1 М NаОН (до рН розчину 9,0), вносили реагент Фентона (суміш солі двовалентного заліза з перекисом водню). Крім того, готували 0,005 мМ розчин БСА в 8 мл дистильованої води. Обидва розчини поєднували, реакційну суміш перемішували протягом 20 год при 4°С, а потім її піддавали діализу проти дистильованої води, центрифугували та ліофільно висушували [4]. Донорами антисироваток слугували кролики породи шиншила. Їх імунізували дворазово підшкірним введенням емульсії кон'югату 2,4-Д — БСА з повним ад'ювантом Фрейнда в об'ємному співвідношенні 1:1. Потім кроликів імунізували чотириразово внутрішньом'язевим введенням кон'югату у фізіологічному розчині в разовій дозі 2 мг на тварину. Кров відбирали з вушної вени на 7—8 день після останьої реімунізації.

Титри антисироваток визначали методом неконкурентного ІФА, сорбуючи на полістірольних мікроплатах кон'югати 2,4-Д — ЯА. Утворення специфічних імунних комплексів виявляли за допомогою кон'югату антикролячого імуноглобуліну G з пероксидазою. При визначенні активності пероксидази в якості хромогену використовували ортофенілендіамін. Його оптичну щільність вимірювали при 492 нм за допомогою вертикального спектрофотометру Sumal РЕ-2, фірми "Carl Zeiss" (Німеччина).

Імуноглобулін G (IgG) із антисироваток виділяли шляхом осадження 33% сульфатом амонію з наступною хроматографією на ДЭАЭ-целюлозі безколоночним способом [9].

ІФА 2,4-Д проводили у 0,01 М Nа — фосфатному буфері, рН 7,4 (ЗФР), незв'язані компоненти відмивали тим же буфером, що містив 0,05% твин-20. Використовували дві схеми аналізу. 1). В лунках мікроплат сорбували кон'югат 2,4-Д — ЯА з 100 мкл ЗФР впродовж 18 год при 4°С, а потім відмивали незв'язані молекули. На слідуючий стадії в лунки вносили суміш, що складалась з 50 мкл проби 2,4-Д та 50 мкл розчину специфічного IgG. Після інкубації протягом 45 хв лунки відмивали та вносили в них по 100 мкл антикролячого кон'югату IgG з пероксидазою хріну. Після 45 хв інкубації та відмивання лунок визначали пероксидазну активність, як зазначено вище. 2). В лунках мікроплат сорбували специфічні IgG з 100 мкл ЗФР впродовж 18 год при 4°С, а потім відмивали в них незв'язаний білок. В подальшому забезпечували одночасну взаємодію імобілізованих антитіл з вільним 2,4-Д та кон'югатом 2,4-Д — ПХ. Після 45 хв інкубації та відмивання визначали пероксидазну активність, як зазначено вище. Для проведення ІФА використовували планшети фірми "Dynatech" (Швейцарія).

Результати та їх обговорення

Більшість пестицидів, у тому числі і 2,4-Д, є гаптенами, а тому набувають імуногенності тільки після кон'югування з білком-носієм. Для забезпечення високих імуногенних властивостей кон'югату велике значення має кількість молекул антигену, що зв'язалась з білком-носієм. Ми враховували цей момент і, до того ж, намагались синтезувати кон'югати, які б відрізнялись оріентацією гаптена на носіях. Для цього використали два шляхи: зв'язування 2,4-Д з білком через карбоксильну групу, що здійснюється досить часто, та через бензольну групу зі стадією утворення активних похідних фенолу. В даній роботі для вивчення впливу структурних особливостей кон'югату на його імуногенність досліджували кон'югат 2,4-Д з БСА по карбоксильній групі (тип К) у співвідношенні 15 моль/моль і кон'югат 2,4-Д з БСА по бензольному ядру (тип Б) у співвідношенні 10 моль/моль (рис. 1).

Таким чином, для імунізації були використані кон'югати 2,4-Д—БСА, що мають різний тип гаптен-білкового зв'язку. Антисироватки, отримані від різних кроликів (імунізованих одним і тим же типом кон'югата), розрізнялися по своїй спроможності зв'язувати антиген. Для проведення подальших експериментів використовували найбільш активні сироватки проти кожного з типів кон'югатів. Сироватку, отриману при імунізації кон'югатом типу К ми позначили як АСК сироватку, а в разі імунізіції тварин кон'югатом типу Б — як АСБ сироватку.

Було проведено порівняльне вивчення імуногенності кон'югатів 2,4-Д—БСА типів К і Б за допомогою неконкурентного ІФА з використанням мічених вторинних антитіл і імобілізованих антигенів. Досліджували сироватки АСК і АСБ у розведенні в 100 раз в подальшому двократному розведенні, тобто від 1:100 до 1:25600. У якості іммобілізованого антигену використовували кон'югат 2,4-Д—ЯА, який готували в концентрації 1 мкг/мл. Результати експериментів, представлені на рис. 2, показують, що характер розвитку вторинної імунної відповіді при реімунізації препаратами кон'югатів залежав від типу зв'язку між 2,4-Д та білком-носієм. Кон'югату 2,4-Д—БСА з приєднанням білка-носія до бензольного кільця властива більша імуногенність у порівнянні з кон'югатом, в якому з'єднання з білком-носієм відбувалося через карбоксильну групу. Криві розведення на рис. 2 демонструють, що концентрація специфічних антитіл більша у першїй сироватці (титр 1:12800), ніж у другій (6400). Перевага кон'югату 2,4-Д з БСА по бензольному ядру в якості імуногену може полягати в орієнтації молекули 2,4-Д відносно носія, а також в тому, що при імунізації детермінантою, якою індукується синтез антитіл, виступає вся молекула 2,4-Д, включаючи карбоксильну групу.

Отримані дані підтверджують існуючі відомості [10] про важливу роль вибору методу кон'югування з білком-носієм у реалізації імуногенних властивостей гаптену.

Для забезпечення стандартизації аналізу надалі при постановці ІФА використовували IgG-фракцію специфічних антитіл. Це дозволяє збільшити чутливість і специфічність аналізу. ІФА виконували конкурентним шляхом. Межі оптимальної концентрації IgG, що дозволяє зберегти необхідну чутливість і лінійність відповіді в діапазоні низьких концентрацій 2,4-Д, підбирали емпірично. З цією метою для даного конкретного варіанту ІФА готували серію послідовних розведень вихідного препарату IgG. Для кожного з них визначали інтенсивність імунної реакції з використанням серії стандартних розчинів антигену. Виходячи з отриманих даних будували калібрувальні криві, при порівнянні яких за такими параметрами, як кут нахилу, перетин з віссю ординат і коефіцієнт кореляції, вибирали режим аналізу, що дозволяє отримати оптимальне сполучення чутливості та лінійності відповіді.

Застосований нами метод імуноаналітичного визначення пестицидів заснований на принципі конкуренції за центри зв'язування антитіл між вільним та імобілізованим на поверхні твердої фази антигеном. Аналіз виконували двома способами. В першому з них для оцінки ступеня зв'язування антитіл використовували антивидові антитіла, мічені пероксидазою хріну. В другому — специфічні антитіла імобілізували на носії, а антиген, що визначався, і кон'югат антигену з ферментом-міткою знаходились в розчині. Іншими словами, імуноферментний аналіз моновалентних антигенів, до яких відноситься пестицид 2,4-Д, грунтується на конкуренції між вільним гаптеном і кон'югатом гаптен-білок за зв'язування з антитілами.

У якості іммобілізованого антигену при виконанні аналізу першим способом використовували кон'югат 2,4-Д із ЯА (0,01 М ЗФР, рН 7,4). Рівень зв'язування антитіл із твердою фазою в лунках, у які не вносили 2,4-Д, вважали таким, що відповідає максимальному і дорівнює 100%. Для кожної концентрації 2,4-Д обчислювали відсоток зв'язування антитіл і будували криву залежності інтенсивності ІФА від кількості даного гербіциду в аналізованому розчині. За чутливість аналізу вважали концентрацію 2,4-Д, що викликала 20% пригнічення імунної реакції порівняно з контролем. У конкурентному аналізі визначали вміст 2,4-Д у стандартних розчинах за допомогою IgG, виділених із поліклональных кролячих антисироваток типу АСК і АСБ (IgGК і IgGБ відповідно).

Дослідження розчинів 2,4-Д першим способом показали, що обидва типи поліклональних антитіл мали високу специфічність (рис. 3). Однак, при використанні антитіл iggК гальмування зв'язування і чутливость аналізу була нижче, ніж у випадку використання iggБ. Калібрувальна крива визначення 2,4-Д за допомогою iggБ має більш пологу форму, завдяки чому збільшується прямолінійна ділянка кривої і діапазон визначуваних концентрацій.

Таким чином, специфічні IgGБ забезпечують більш чутливий аналіз, ніж Ig GК. Можливо, це обумовлено тим, що детермінантою, на яку виробляються антитіла типу IgGБ, виступає вся молекула 2,4-Д, включаючи карбоксильну групу. Іншими словами, детермінанта в цьому випадку більш адекватна вихідній молекулі 2,4-Д. Тому антитіла, отримані при імунізації кон'югатом, виготовленим по типу Б, можуть більш специфічно взаємодіяти з вільним 2,4-Д.

Для проведення конкурентного аналізу 2,4-Д з використанням кон'югату 2,4-Д з пероксидазою хріну були проведені попередні дослідження по підбору найбільш відповідних кон'югатів, що готували за різного співвідношення пероксидази та 2,4-Д.

Встановлено, що найбільш ефективними для забезпечення чутливого аналізу виявились кон'югати з молярним співвідношенням 2,4-Д до пероксидази 4:1. При їх використанні відмічена вища пероксидазна активність при меншій кількості міченого препарату. Саме цей кон'югат 2,4-Д—ПХ та IgGБ використовували при побудові калібрувальної кривої для визначення 2,4-Д при обраних оптимальних режимах ІФА (рис. 4).

Порівняння результатів обох схем проведення конкурентного аналізу вмісту 2,4-Д дещо відрізнялись по граничним рівням визначення цього гербіциду: для першої схеми цей рівень становив 10 нг/мл, а для другої — 1 нг/мл.

Таким чином, конкурентний ІФА з використанням специфічних ІgG, отриманих до кон'югатів 2,4-Д—БСА (з приєднанням гербіциду по бензольній групі до білка-носія) та кон'югату 2,4-Д з пероксидазою хріну з молярним співвідношенням, що дорівнює 4:1, виявився найбільш чутливим в порівнянні з іншими випробуванними схемами та імунореагентами. Показана можливість варіювання чутливістю і специфічністю ІФА при використанні різних комбінацій імунореагентів та умов проведення аналізу.

Література
1. Mazzullo M., Mesirca R., Paolini M., Cantelli G., Perocco P., Ciaccia P., Grilli S. A database for evaluating the toxicological risk of pesticides // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. —1997. —V. 16, N2—3. —P. 231—237.
2. Гербициды / Ред. Захаренко В.А. —М.: Агропромиздат, 1990.
3. Методы определения микроколичеств пестицидов / Под. ред. М.А. Клисенко. —М.: Медицина, 1984. —256 с.
4. Ковалев И.Т., Полевая О. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим субстанциям. —М.: Наука, 1985.
5. Van Emon J., Seiber J.N., Hammock B.D. Immunoassay techniques for pesticide analysis. In: Analytical methods for pesticide and plant growth regulators: Advanced analytical techniques. N.Y.: Academic Press, 1989. —V. XXVII. —P. 217—263.
6. Jung F., Gee S.J., Harrison R.O., Goodrow M.N., Karu A.E., Braun A.L., Li Q.X., Hammock B.D. Use of immunochemical techniques for the analysis of pesticide residues // Pestic. Sci. —1989. —V. 26. —P. 303—317.
7. Коростылева Е.А., Мельниченко О.А., ТумановА.А. Иммунохимические методы определения пестицидов при екологическом контроле // Журн. анал. химии. —1991. —Т. 46. —С. 2314—2324.
8. Чигрин А.В. Иммунохимический анализ и его применение для определения остаточных количеств пестицидов // Агрохимия. —1992. —N3. —С. 110—121.
9. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ. / Под. ред. Д. Кэтти. —М.: Мир, 1991. —С. 105—106.
10. Еремин С.А. Иммунохимический анализ лекарств и органических соединений // Журн. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. —1989. —Т. 34. —№1. —С. 46—51.