ВПЛИВ ПЕНТОКСИФІЛІНУ НА ПОКАЗНИКИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ ТА ВМІСТ НІТРИТУ ЗА УМОВ ІНТОКСИКАЦІЇ ХЛОРИДОМ КОБАЛЬТУ

Інститут терапії АМН України, м. Харків

Іони важких металів, такі як кобальт, можуть викликати порушення рівноваги між активними формами кисню та системами антиоксидантного захисту в бік зростання рівня реактивного кисню та зменшення вмісту антиоксидантів, що супроводжується активацією ланцюгових реакцій окислення ліпідів, розвитком окислювального стресу. Прооксидантна роль кобальту за цих умов пов'язана з його здатністю безпосередньо взаємодіяти з вільними радикалами кисню та пероксидом водню, активувати ферментні системи генерації реактивних форм кисню, індукувати синтез прозапальних цитокінів [1]. Останні, в свою чергу, можуть активувати синтез супероксиду, гідроксильного радикалу та оксиду азоту. Роль оксиду азоту за умов окислювального стресу не є однозначною. З одного боку, оксид азоту реагує з супероксидом, що призводить до втрати ними вільнорадикальних властивостей та утворення пероксинітриту, що в ряді випадків розглядається як захисна реакція [2]. З іншого боку, оксид азоту як вільнорадикальна сполука може взаємодіяти з поліненасиченими жирними кислотами, що викликає активацію процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ).

Для пригнічення окислювальних процесів можуть бути використані інгібітори прозапальних цитокінів, серед яких похідне ксантину — пентоксифілін (3,7-диметил-1-оксогексил-ксантин) [3].

Мета дослідження — на підставі дослідження окислювальних процесів визначити роль змін вмісту маркеру синтезу оксиду азоту — нітриту при інтоксикації хлоридом кобальту та можливості їх попередження за допомогою пентоксифіліну (ПФ).

Матеріали та методи дослідження

Дослідження проведено на щурах-самцях лінії Wistar 3-х місячного віку масою 180—220 г, що утримувались у стандартних умовах віварію Харківського національного університету. Тварин розподіляли на групи, яким вводили внутрішньоочеревинно:
— хлорид кобальту (СоСl₂•6H₂O) у 0,9% розчині NaCl з розрахунку 3 мг на 100 г маси тіла [4];
— розчин ПФ з розрахунку 15 мг на 100 г маси тіла за 2 год до введення хлориду кобальту;
— відповідний об'єм фізіологічного розчину — контрольні тварини.

Тварин декапітували під ефірним наркозом через 2 год після введення хлориду кобальту або фізіологічного розчину. Печінку перфузували охолодженим фізіологічним розчином. Тканини легень, серця, печінки та нирок гомогенізували при 4—6°C з розрахунку 300 мг/3 мл фізіологічного розчину. Зразки зберігали при 20°C до аналізу.

Дослідження продуктів пероксидації ліпідів (ПОЛ): дієнових кон'югатів (ДК), кетодієнів і сполучених триєнів (КД+СТ) у складі нейтральних ліпідів (НЛ) та фосфоліпідів (ФЛ) проводили в гептан-ізопропанольних (4:6) екстрактах гомогенатів тканин при 232 та 278 нм, відповідно. Рівень гідропероксидів ліпідів (ГПЛ) визначали в реакції з тіобарбітуровою кислотою за такою схемою: до 0,1 мл гомогенату додавали 0,1 мл 0,27% розчину хлорного заліза, 0,1 мл 0,22% розчину бутилокситолуолу, 1,5 мл 0,2 М гліцеринового буферу рН 3,6 та 1,5 мл 0,5% тіобарбитурової кислоти з 0,3% додецилсульфатом натрію. Суміш витримували 15 хв при температурі 100°С, охолоджували та додавали 1 мл льодяної оцтової кислоти і 2 мл хлороформу. Потім суміш струшували та центрифугували при 1500 об/хв протягом 5 хв та визначали оптичну щільність при довжині хвилі 532 нм. Дослідження продуктів ПОЛ проводили із використанням спектрофотометру СФ-26 (Росія). Для перерахунку оптичної густини у концентрацію враховували коефіцієнт екстинції, який дорівнює 1,56•10⁵М^-1•см^-1.

Вміст нітриту визначали фотометричним методом за реакцією Гриса. Зразки депротеїнізували доданням 75 мМ/л ZnSО₄ та 55 мМ/л NaOH 1:1:1,2 за об'ємом, відповідно, центрифугували 15 хв при 3000 об/хв. на центрифузі РС-6; до 200 мкл супернатанту додавали 20 мкл 1% сульфонаміду та 20 мкл 0,1% N-1-нафтилетилендіаміндигідрохлориду в 5% HCl [5]. Оптичну щільність визначали через 20 хв при 540 нм з використанням багатоканального мікроспектрофотометра фірми "Flow" (Великобританія).

Вміст нітриту розраховували у нМ/г тканини, ГПЛ — у мкМ/г тканини, ДК, КД+СТ — у DЕ/г тканини.

В дослідженні використано N-(1-нафтил)-етилендіамінддигідрохлорид, сульфаніламід фірми ICN (США), бутилокситолуол фірми MERCK (Німеччина), інші реагенти — вітчизняного виробництва кваліфікації "хч".

Статистичну обробку отриманих даних проводили за методом Стьюдента-Фішера.

Результати та їх обговорення

При введенні хлориду кобальту рівень ГПЛ значно зростає у серці, печінці, нирках і не змінюється у легенях (рис. 1). Введення ПФ попереджує збільшення вмісту ГПЛ у печінці, але в серці, нирках він залишається підвищеним порівняно з контролем, а у легенях — знижується нижче контрольного рівня.

За умов введення хлориду кобальту рівень первинних продуктів ПОЛ — ДК у складі НЛ вірогідно зростає порівняно з контролем у всіх досліджених органах, окрім серця (рис. 2). У складі ФЛ вміст ДК суттєво збільшується в легенях та знижується в печінці. Під впливом ПФ відзначено стабілізацію вказаних змін ДК.

Встановлено зростання вмісту вторинних продуктів ПОЛ — КД+СТ за умов інтоксикації у фракції НЛ в легенях, серці, нирках, у фракції ФЛ — в серці, а в нирках спостерігали його зниження (рис. 3). Попереднє введення ПФ запобігає зростанню вмісту КД+СТ в НЛ у легенях і нирках, тоді як у печінці його рівень зростає; у фракції ФЛ виявлено високий рівень КД+СТ в серці, низький — в нирках порівняно з контролем.

За умов CoCl₂-індукованого окислювального стресу виявлено вірогідне підвищення вмісту нітриту в усіх досліджених органах, особливо у серці та печінці (рис. 4). При попередньому введенні ПФ відзначено обмеження ефекту хлориду кобальту щодо зростання рівня no₂^- в серці, печінці та нирках та відсутність змін у легенях. Рівень нітриту залишається підвищеним у всіх досліджених органах порівняно з контрольною групою.

Відсутність змін ГПЛ в легенях за умов інтоксикації може бути обумовлена меншим накопиченням кобальту, нижчою інтенсивністю процесів ПОЛ або значно вищою, ніж у інших органах, активністю жиророзчинних антиоксидантів, таких як a-токоферол [6]. Але високий вміст ДК в легенях не тільки в НЛ, але і в ФЛ-фракції, на відміну від інших органів, у свою чергу може бути обумовлений локальною активацією утворення кон'югованих продуктів ПОЛ через рекомбінацію пероксо- та карбонових радикалів, які є похідними ГПЛ.

Зниження вмісту ДК у фракції ФЛ в печінці на фоні зростанням рівня ДК в НЛ за умов інтоксикації свідчить, скоріше за все, про локальну активацію антиоксидантних ферментів, а також жиророзчинних мембранопов'язаних антиоксидантів, можливо a-токоферолу, ретинолів, убіхінонів та ін. З іншого боку, відомо, що за окислювального стресу відбувається активація ендогенних фосфоліпаз типу А, які активно відщеплюють окислені ацили поліненасичених жирних кислот ФЛ з їх можливим надходженням у фракцію НЛ.

Слід зазначити, що у серці в контролі виявлено високий рівень ДК у ФЛ-фракції та КД+СТ в обох фракціях, порівняно з іншими органами. Це може бути обумовлено природно високою інтенсивністю процесів вільнорадикального окислення в цьому органі. Крім того, відзначено високий вміст КД+СТ в ФЛ нирок у контролі, що є показником низької активності антиоксидантних ферментів у цьому органі.

Виявлене підвищення всіх досліджених показників у серці за умов інтоксикації узгоджується з відомими даними про кардіотоксичну дію кобальту [7].

Відсутність змін КД+СТ в печінці, скоріше за все, обумовлено більшою локальною активністю систем антиоксидантного захисту.

Виявлене зростання вмісту нітриту може бути чинником ушкодження тканин цитотоксичною похідною NO — периксинітритом [2, 8]. У ліпідному біслої NO може реагувати з ліпідними пероксидними радикалами з утворенням стабільних органічних нітратів, що ефективно гальмує процеси ПОЛ. Надлишок утворення NO є важливим компонентом механізмів, відповідальних за розвиток запалення та аутоімунних процесів, дисфункції ендотелію, атеросклерозу та інш. [8]. Причиною зростання рівня нітриту за умов інтоксикації може бути активація індуцибельного синтезу NO реактивними формами кисню [9]. З іншого боку, вільні радикали, особливо пероксиди, збільшують вміст внутрішньоклітинного Са²⁺ і тим самим сприяють активації Са²⁺-залежних ізоформ NO-синтаз [8], що також може бути чинником зростання вмісту нітриту у тканинах.

Зростання вмісту нітриту в легенях і серці на фоні збільшення рівня і первинних, і, особливо, вторинних продуктів ПОЛ за умов інтоксикації може свідчити про недостатній потенціал антиоксидантного захисту та розвиток ураження вказаних органів, властивості NO за цих умов не є чітко визначеними. В печінці NO має, скоріше за все, антиоксидантні властивості, тому що виявлено відсутність змін вторинних продуктів ПОЛ. В нирках внаслідок високого вихідного рівня вторинних продуктів ПОЛ та їх зниження у ФЛ за умов інтоксикації реалізація захисту, можливо, обумовлена вивільненням мембранопов'язаних антиоксидантів, а не участю NO.

Високий рівень нітриту на тлі введення ПФ у легенях, скоріше за все, свідчить про захисний характер NO, оскільки спостерігається обмеження утворення і первинних, і вторинних продуктів ПОЛ.

За умов впливу ПФ виявляється кореляція у зниженні вмісту нітриту і ГПЛ у серці, хоча їх рівень лишається вище за контрольний. Функцію NO за вказаних умов можна вважати прооксидантною, оскільки зростає рівень вторинних продуктів ПОЛ.

Слід зазначити, що ПФ пригнічує синтез фактору некрозу пухлин та ряду інших цитокінів і, таким чином, опосередковано впливає на активність запального процесу та індуцибельний цитокін-залежний синтез NO [3]. Можна припустити, що зростання вмісту нітриту за умов СоСl₂-індукованого стресу частково обумовлено активацією індуцибельного синтезу NO, оскільки ПФ спричиняє його обмеження. Відсутність нормалізації вмісту нітриту при застосуванні ПФ обумовлена збереженням високої інтенсивності вільнорадикальних процесів, накопиченням вторинних продуктів ПОЛ у органах, де їх зростання за окислювального стресу не спостерігали, а саме КД+СТ в НЛ печінки, або воно було менш виразним, ніж в ФЛ нирок. Саме за цих умов NО може діяти як антиоксидант [2]. Крім того, можна припустити прискорення метаболізму первинних продуктів ПОЛ під впливом ПФ в печінці. Щодо змін в нирках, NO взаємодіє з ГПЛ з утворенням нітропохідних жирних кислот.

Відомо, що a-2-макроглобулін (a-2-МГ) здатний підвищувати синтез NO макрофагами за рахунок активації індуцибельної NO-синтази [10]. Попереднє введення ПФ запобігає зниженню рівня a-2-МГ за умов СоСl₂-індукованого стресу [4]. Відповідно, підвищений порівняно з контролем вміст нітриту за умов попереднього впливу ПФ може бути обумовлений участю a-2-МГ і свідчити про суттєву роль індуцибельного синтезу NO. Відзначене за умов введення ПФ в легенях локальне зниження рівнів продуктів ПОЛ без зміни вмісту нітриту, скоріше за все, пов'язано саме з цим фактом.

Таким чином, інтоксикація хлоридом кобальту призводить до активації процесів ПОЛ та збільшення вмісту нітриту в легенях, серці, печінці та нирках. Активація ПОЛ за умов інтоксикації має тканеспецифічний характер і особливо проявляється в зростанні утворення первинних продуктів ПОЛ в печінці, кон'югованих продуктів — в легенях. Підвищення вмісту нітриту в печінці за умов інтоксикації має захисний характер, в нирках його антиоксидантні властивості менш виразні, а в серці і легенях NO може мати цитотоксичну дію. Попереднє введення ПФ повністю не запобігає активації процесів ПОЛ та збільшенню вмісту нітриту. Нормалізація вмісту продуктів ПОЛ в легенях за умов введення ПФ може бути обумовлена антиоксидантними властивостями NO, аналогічні ефекти NO, скоріше за все, характерні і для печінки та нирок, а в серці NO може діяти як прооксидант.

Література
1. Gueniche A., Viac J., Lizard G. Effect of various metals on intercellular adhesion molecule-1 expression and tumour necrosis factor alpha production by normal human keratinocytes // Arch. Dermatol. Res. —1994. —V. 286, №8. —Р. 466—470.
2. Реутов В.П. Медико-биологические аспекты цикла оксида азота и супероксидного анион-радикала // Вестник РАМН. —2000. —N4. —С. 35—41.
3. Marcinkiewicz J., Grabowska A., Lauterbach R., Bobek M. Defferential effects of pentoxifylline, a non-specific phosphodiesterase inhibitor, on the production of IL-10, IL-12 P-12 and p 35 subunits by murine peritoneal macrophages // Immunologpharmacology. —2000. —V. 49, N3. —P. 335—343.
4. Калiман П.А., Самохiн А.А., Самохiна Л.М. Вплив пентоксифiлiну на систему протеїназа-iнгiбiтор протеїназ у щурiв при введеннi хлориду кобальту // Медична хiмiя. —2000. —Т. 2, N2. —С. 38—41.
5. Nakamura T., Ohyama Y., Masuda H., Kurashina T., Saito Y., Kato T., Sumino H., Sato K., Sakamaki T., Sasaki A., Nagai R. Chronic blocade of nitric oxide synthesis increases urinary endothelin-1 excretion // J. of Hypertension. —1997. —V. 15, N4. —P. 373—382.
6. Суворов Н. М., Добрынина В.В., Климец И. С. Распределение кобальта в организме и его действие на обменные процессы // Врач. дело. —1982. —№2. —С. 107—110.
7. Christensen J.M., Poulsen O.M. A 1982-1992 surveillance programme on Danish pottery painters. Biological lewels and healts effects following exposure to soluble or insoluble cobalt blue dyes // Science of Total Environmental. —1994. —V. 150, №1-3. —Р. 95—104.
8. Зотова И.В., Затейщиков Д.А., Сидоренко Б.А. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза // Кардиология. —2002. —№4. —С. 58—67.
9. Kuo P.C., Abe K., Schroeder R.A. Superoxide Enhances Interleukin-1beta-Mediated Transcription of the Hepatocyte-Inducible Nitric Oxide Synthase Gene // Gastroenterology. —2000. —V. 118, N3. —P. 608—618.
10. Веремеенко К.Н., Кизим А.И., Досенко В.Е. a-2-макроглобулин: структура, физиологическая роль и клиническое значение // Лаб. диагностика. —2000. —№2. —С. 3—8.

| Зміст |