|
МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЙ УДК 615.9:617.721:577.17:612.015.11:577.152.261 Л.В. Бойцова, к.б.н. УЧАСТИЕ ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ И ГЛУТАТИОН-ДЕГРАДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОЦЕССАХ МЕТАБОЛИЗМА ДИ-(2-ХЛОРЕТИЛ)-СУЛЬФИДА У КРЫСИнститут фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев Глутатион играет уникальную роль в формировании резистентности организма к самым различным химическим и физическим воздействиям [1—3]. Процессы связывания восстановленного глутатиона с электрофильными веществами [4, 5] играют большую роль в детоксикации, в том числе и алкилирующих соединений, применяемых для лечения злокачественных новообразований [6, 7]. Снижение содержания восстановленного глутатиона в клетках карциномы яичников D,L-бутионин-S,R-сульфоксимином приводит к повышению цитоксичности алкилирующих противоопухолевых препаратов мефалана и азотистого иприта [8] с увеличением количества поперечных сшивок в молекулах ДНК, что вызвано снижением конъюгации данных соединений с глутатионом. При поступлении ди-(2-хлоретил)-сульфида в организм в первые 24 ч происходит выведение 60% от вводимой дозы алкилирующего агента. При этом в моче появляется ряд метаболитов, большинство из которых образуется в процессе его конъюгации с восстановленным глутатионом [9]. Конъюгаты в дальнейшем метаболизируются в N-ацетилцистеинконъюгаты или метилтио/метилсульфонил производные, возможно, по пути, включающем участие b-лиазы, что сопровождается окислением атома серы ди-(2-хлоретил)-сульфида в сульфоксид или сульфон [10]. Однако в этих работах, главным образом, охарактеризован качественный и количественный состав метаболитов, но не исследовалось состояние ферментативных систем, принимающих участие в их образовании. Учитывая, что метаболизм ди-(2-хлоретил)-сульфида происходит с вовлечением глутатионовой системы, а функциональное состояние ферментов, связанных с этими процессами, практически не изучено, представляется целесообразным исследовать содержание восстановленного глутатиона, активности глутатионтрансферазы, g-глутамилтранспептидазы, пептидазы, аминопептидазы М, b-лиазы в печени и почках крыс под воздействием алкилирующего агента в дозе 1/2 ЛД50. Эти эксперименты направлены на выяснение возможного пути снижения цитотоксического действия ди-(2-хлоретил)-сульфида, связанного с процессами детоксикации алкилирующего агента в организме. Материалы и методы исследования Опыты проведены на 70 белых крысах-самках линии Wistar с массой тела 180—240 г, которые содержались на стандартном рационе вивария. Ди-(2-хлоретил)-сульфид вводили однократно подкожно, в масляном растворе в дозе 1/2 ЛД50 (2,5 мг/кг). В каждом варианте эксперимента использовали по 6 животных. Через 15, 30 мин, 1, 3, 6 ч, 1, 3 суток животных декапитировали под наркозом. Забор печени и почек для дальнейших биохимических исследований проводили на холоду. Печень отмывали от эритроцитов холодным физиологическим раствором, почки декапсулировали. Определение содержания восстановленного глутатиона проводили в депротеинизированном цитозоле флюорометрическим методом [11] с регистрацией показателей на флуориметре Hitachi MPS-4 (Япония). В качестве флюоресцентного реагента использовали о-фталевый альдегид ("Sigma", США). Супернатант и цитозоль из гомогената печени получали методом дифференциального центрифугирования при 100000 g на протяжении 1 ч на центрифуге МSF-65 (Англия) [12] с угловым ротором. Мембраны щеточной каймы почек выделяли по методу [13]. Активность глутатионтрансферазы в цитозоле (ГТ) оценивали по связыванию восстановленного глутатиона с хлординитробензолом ("Serva", Германия) [14], а b-лиазы в супернатанте — по степени окисления NADH ("Sigma", США) [15] в сопряженной реакции с лактатдегидрогеназой ("Sigma", США) при 340 нм. Активность мембраносвязанных ферментов почек определяли: g-глутамилтранспептидазы (g-ГТП) — по убыли g-a-глутамилпаранитроанилида ("Sigma", США) [16], дипептидазы — при помощи нингидрин-цианидного метода [17] по степени гидролиза L-Ala-Gly ("Sigma", США); аминопептидазы М [18] — по уменьшению L-Leu-p-нитроанилида ("Sigma", США) при 410 нм. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Shimadzu MPS-500 (Япония). Содержание белка в супернатанте, цитозоле и суспензии мембран микроворсинок определяли по методу Лоури [19]. Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение Результаты по изучению содержания восстановленного глутатиона и активности ферментов, принимающих участие в метаболизме ди-(2-хлоретил)-сульфида представлены в таблице и на рисунке. В ранние сроки после введения ди-(2-хлоретил)-сульфида (через 15 мин, 3, 6 ч) в ткани печени отмечено снижение содержания восстановленного глутатиона. Параллельно с этим регистрируется стойкое повышение общей цитозольной активности ГТ. Алкилирующим соединениям присущи выраженные электрофильные свойства, что дает им возможность активно взаимодействовать с веществами, содержащими нуклеофильные группы [20]. Поэтому в процессе биотрансформации ди-(2-хлоретил)-сульфида в значительной степени задействована универсальная система детоксикации — система глутатиона и ферментов его метаболизма. Снижение концентрации глутатиона и увеличение активности ГТ служат доказательством повышения уровня процессов конъюгации в ткани печени с образованием соответствующих тиоэфиров в первые 6 ч после введения алкилятора. Одной из возможных причин снижения в печени пула восстановленного глутатиона, помимо ферментативного связывания, является прямое взаимодействие SH-групп трипептида с ди-(2-хлоретил)-сульфидом. В первые 30 мин после поступления исследуемого вещества в организм его цитотоксический эффект проявляется снижением активности глутатион-деградирующих ферментов: g-ГТП и b-лиазы. Возможно, это связано с нарушением баланса между содержанием конъюгатов глутатиона в клетке с алкилирующим соединением и процессами их внеклеточного транспорта. Повышение процессов катаболизма глутатиона и его конъюгатов наблюдалось через 1 ч после введения исследуемого вещества. Так, на фоне нормализации активности g-ГТП — фермента, который инициирует первый этап деградации восстановленного глутатиона и его тиоэфиров с отщеплением g-глутамильного остатка, регистрировалось повышение активности дипептидазы и аминопептидазы М в мембранах микроворсинок щеточной каймы почек на 20,8% и 33,8%, соответственно, по отношению к интактным животным. Пик g-ГТП активности отмечается к 3-му часу интоксикации. В это время регистрируется повышение как пептидазной активности на 21,5%, так и стойкое увеличение активности аминопептидазы М до конца срока наблюдения. Эти данные являются свидетельством того, что в катаболизме ди-(2-хлоретил)-сульфида существенную роль играет система глутатиона, активность которой направлена на снижение цитотоксических эффектов алкилирующего вещества за счет образования менее токсичных и реакционноспособных метаболитов. Метаболизм S-замещенных цистеиновых конъюгатов, катализируемых цистеинконъюгат b-лиазой, по-видимому, не притерпевает существенных изменений при введении 1/2 ЛД50 исследуемого вещества: кратковременное снижения активности фермента (15 мин) нормализовалось в дальнейшие сроки наблюдения по сравнению с интактными животными. Снижение содержания восстановленного глутатиона в ткани печени через 24 ч сопровождается компенсаторным повышением концентрации трипептида. Полученные нами результаты подтверждают данные Britten и Green [21], которые экспериментально показали, что одним из главных компонентов клеточного ответа на воздействие алкилирующих агентов может быть компенсаторное повышение в тканях содержания глутатиона. Необходимо отметить, что повышение уровня восстановленного глутатиона в клетках, возможно, играет защитную роль, как это показано для фенилаланинового иприта, которая состоит в стимуляции процессов репарации и предохранении макромолекул от алкилирования [22]. Кроме того, восстановленный глутатион в повышенных концентрациях является отрицательным модулятором процессов пролиферации, что может снизить прямую генотоксичность ди-(2-хлоретил)-сульфида для репродуктивного пула клеток [23]. Не было отмечено изменений в содержании восстановленного глутатиона в ткани почек во все сроки наблюдения. Этот факт, возможно, свидетельствует о том, что алкилирующее соединение в дозе 1/2 ЛД50 подвергается быстрой детоксикации в тканях с высокой митотической активностью и печени, существенно ограничивающего поступление в ткани почек исходного вещества. Таким образом, цитотоксическое действие ди-(2-хлоретил)-сульфида на глутатионовую систему проявляется нарушением тиолового статуса клеток печени: снижение содержания восстановленного глутатиона в ранний период интоксикации с компенсаторным повышением концентрации трипептида через 1 сут после его введения, а также уменшением активности g-глутамилтранспептидазы и >b-лиазы в первые 30 мин после поступления ксенобиотика в организм. Ди-(2-хлоретил)-сульфид вызывает стойкое повышение активности цитозольной ГТ с дальнейшим увеличением активности глутатион-деградирующих ферментов в мембранах микроворсинок щеточной каймы почек. Вышеприведенные результаты свидетельствуют о том, что один из возможных путей метаболической инактивации ди-(2-хлоретил)-сульфида связан с глутатионовой системой и функционированием глутатион-деградирующих ферментов. Литература |