МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЙ УДК 547-311:613.632:577.31 И.Ю. Высоцкий, к.м.н. ЦИРКАДНЫЕ И ЦИРКАННУАЛЬНЫЕ РИТМЫ ТОКСИЧНОСТИ ЭПИХЛОРГИДРИНАСумский государственный университет В настоящее время в химической промышленности широко используется эпихлоргидрин (ЭХГ), который применяется в качестве промежуточного продукта в производстве многих химических веществ и главным образом глицерина и эпоксидных смол. ЭХГ представляет собой реакционноспособное и довольно токсичное соединение, поступающее в организм человека преимущественно в условиях производства при его вдыхании или попадании на кожу. Данные, полученные в исследованиях на людях, а также результаты экспериментов на животных свидетельствуют о действии ЭХГ на центральную нервную систему, дыхательную систему, печень, кровь, глаза и кожу [16]. При определении токсичности эпоксидных смол, ЭХГ, других химических соединений, мы обнаружили весьма широкие колебания основных параметров токсикометрии в различных экспериментах [3, 5, 9]. Поскольку физиологические процессы различных систем организмов в разные временные периоды могут быть на разном уровне функционирования, вполне вероятно, что именно биоритмы лежат в основе неодинаковой реакции организма на воздействие в разные часы суток, сезоны года и разные годы, [15]. Суточные и сезонные отклонения в токсичности ксенобиотиков и эффективности лекарств были показаны на животных [1, 2, 15, 31], а в некоторых случаях и на человеке [23, 28]. Даже смерть или выживание индивида при действии токсического агента могут зависеть от времени суток, месяца или сезона года [32]. Последнее позволило нам сделать предположение, что наиболее вероятными факторами, определяющими колебания токсичности ЭХГ, являются, по-видимому, время суток и сезон года, то есть циркадные и цирканнуальные биологические ритмы [4]. Исследования в этом направлении могут послужить первым этапом на пути подбора оптимальных вариантов режимов посменной работы у сменных рабочих, занятых на производстве ЭХГ, эпоксидных смол, стеклопластиков и других полимерных материалов, в синтезе которых применяется ЭХГ. Целью данной работы было изучение влияния суточных и сезонных биоритмов на токсичность одного из наиболее опасных летучих компонентов эпоксидных смол — ЭХГ при смертельных и близких к пороговым уровнях воздействия. Материалы и методы исследования Исследования проводили на отдельных группах животных, сравнимых по генетическому фону, возрасту, полу и условиям содержания. Использовали крыс-самцов линии Wistar массой 140—180 г. Животные в течение 14 дней перед исследованием и в дальнейшем в ходе эксперимента содержались в звукоизолированных с контролируемой температурой искусственно освещаемых комнатах при соотношении светового и темнового периодов 12:12. Свет с 06 до 18 ч сменялся темным периодом с 18 до 06 ч. Температуру в комнатах поддерживали в пределах 22—24°С. Исследования проводили с 4-х часовым интервалом с 06 ч одного дня до 06 ч другого дня. Животным с целью определения суточных колебаний ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛД99 ЭХГ вводили внутрижелудочно однократно в виде 5% раствора, приготовленного на растительном масле, в 06, 10, 14, 18, 22 и 02 ч в дозах от 40 до 190 мг/кг, а сезонных колебаний — зимой, весной, летом и осенью в 12 ч в дозах от 40 до 250 мг/кг. После воздействия белых крыс возвращали в свои клетки и содержали при том же световом режиме, что и до введения ЭХГ, фиксируя при этом в течение 14 последующих дней количество погибших животных. Основные параметры токсичности рассчитывали с помощью метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности и экспресс-метода [7, 13, 14]. Суточные и сезонные особенности токсичности ЭХГ изучали также при введении его в дозе 13,5 мг/кг (1/10 ЛД50 в 14 ч). Животных брали в исследование осторожно, через 4 ч после однократного внутрижелудочного введения яда. Если исследование проводили в темный промежуток времени, то использовали слабое освещение. Крыс умерщвляли путем декапитации (под рауш-наркозом) немедленно после переноса их из комнаты для периодических исследований в соседнюю с ней лабораторию. В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) [30], а в печени — содержание сульфгидрильных (SH-) групп [17]. У части крыс определяли длительность выделения бромсульфалеина (БСФ) с желчью [10, 11]. Полученные в эксперименте данные обрабатывали статистически с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение Результаты исследований, приведенные в табл. 1, свидетельствуют о том, что основные параметры токсичности ведущего летучего компонента эпоксидных смол — ЭХГ подвержены выраженным циркадным колебаниям. Для того, чтобы вызвать 50% гибель животных необходима большая циркадная вариабельность дозировки. Так, если в 06 ч ЛД50 этого соединения составляла 100,57±8,93 мг/кг, то в 10 и 14 ч она возрастала примерно на 32—34%, а в 18, 22 и 02 ч уменьшалась соответственно на 10, 22 и 30%. Максимум ЛД50 ЭХГ наблюдался в 10—14 ч, а минимум — в 22—02 ч. Следовательно, в 22 и особенно в 02 ч крысы очень чувствительны к исследуемому галоидуглеводороду, применяемому даже в дозах 78,87±16,48 и 70,63±14,40 мг/кг, которые вызывают 50% гибель животных. В 10—14 ч крысы минимально восприимчивы к действию яда и для 50% их гибели необходимы дозы 132,68±10,85 — 134,40±16,61 мг/кг, т.е. примерно в 1,7—1,9 раза больше, чем в середине темного периода времени. В отношении ЛД16, ЛД84 и ЛД99 также характерны циркадные вариации и разница между результатами колебаний ЛД50 и вышеприведенных параметров токсичности небольшая. Дозы, необходимые для 16, 84 и 99% гибели животных в 02 ч (время относительно низкой резистентности белых крыс к ЭХГ), составляли соответственно 45,68, 95,57 и 128,50 мг/кг и были по сравнению с дозами 101,19, 167,62 и 211,50 мг/кг в 14 ч (время высокой резистентности белых крыс к токсическому действию ЭХГ) в 2,2, 1,75 и 1,6 раза ниже. Противоположные результаты были получены при однократном внутрижелудочном введении ЭХГ в различное время суток в дозе 13,5 мг/кг. Как видно из табл. 2, наименьшая чувствительность, т.е. наибольшая устойчивость белых крыс-самцов к ЭХГ при его внутрижелудочном введении, установлена в темный период суток между 18 и 02 ч. Так, в 18 и 22 ч не отмечалось заметных сдвигов в уровне sh-групп в печени и активности АлАТ в сыворотке крови. Удлинение на 22% времени выделения БСФ с желчью в 18 ч и повышение на 30% активности АлАТ в 02 ч было статистически не достоверным. Наибольшая чувствительность животных к изучаемому соединению отмечалась между 6 и 14 ч, т.е. во время периода покоя. На этом отрезке времени суток ЭХГ вызывал статистически значимое уменьшение содержания сульфгидрильных групп в печени при его введении в 6 и 10 ч, увеличение времени выделения БСФ с желчью — в 6, 10 и 14 ч и повышение активности АлАТ в сыворотке крови — в 14 ч. Характерно, что наибольшее снижение уровня sh-групп в печени (на 37%), увеличениe времени экскреции с желчью БСФ (на 44%) и повышениe активности АлАТ в сыворотке крови (на 69%) отмечалось в период с 10 до 14 ч. Таким образом, при применении летальных доз ЭХГ крысы более чувствительны к нему в 22—02 ч, а при использовании ЭХГ в дозах, близких к пороговым (1/10 ЛД50), чувствительность крыс, напротив, значительно выше в 10—14 ч. Наряду с циркадными ритмами довольно выраженное влияние на токсичность ЭХГ, применяемого как в смертельных, так и близких к пороговым (1/10 ЛД50) дозам, оказывают цирканнуальные биологические ритмы. Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что акрофаза ЛД50 ЭХГ наблюдалась в зимний период года. В этот сезон ЛД50 ЭХГ была в 2,2 раза выше, чем летом и в 1,4; 1,5 раза выше, чем весной и осенью соответственно. Аналогичная картина отмечалась и со стороны ЛД16, ЛД84 и ЛД99. Максимальные значения этих показателей наблюдались в зимний сезон, минимальные — в летний, средние — весной и осенью. При однократном внутрижелудочном введении ЭХГ в различные сезоны года (табл. 4) в дозе 13,5 мг/кг его токсическое действие, судя по наиболее чувствительным показателям (sh-группы, БСФ, АлАТ), имело свои особенности. Так, если в зимний сезон уровень sh-групп в печени уменьшался на 44%, длительность выделения БСФ с желчью возрастала на 66%, а активность АлАТ в сыворотке крови увеличивалась на 44%, то весной эти показатели изменялись соответственно на 34, 24 и 36%, осенью — на 20, 19 и 19%, а летом — на 23, 13 и 4%. Анализируя результаты цирканнуальных ритмов токсичности ЭХГ на уровне смертельных доз можно заключить, что она наиболее высокая (ЛД50 низкое) в летнее время года, а наиболее низкая (ЛД50 высокое) — зимой. При применении ЭХГ в дозах порядка 1/10 ЛД50 сезонные ритмы токсического действия этого соединения, как и в случае суточных биоритмов, изменяется противоположным образом — максимумом зимой, а минимумом — летом и осенью. Резюмируя вышеизложенное, можно сказать, что токсичность ЭХГ в значительной степени определяется суточными и сезонными биологическими ритмами. Анализ ритмов реакции организма на действие ЭХГ показывает, что чувствительность к этому соединению при различной интенсивности воздействия не совпадает по часам суток и сезонам года. Чувствительность к ЭХГ в дозе, близкой к пороговой, отстоит от фазы чувствительности к среднесмертельной дозе при изучении суточных ритмов на 12 ч, а сезонных — приблизительно на 180 дней. При воздействии ЭХГ в невысоких дозах (1/10 ЛД50) максимальная реакция отмечалась в середине светлого периода времени и в зимний сезон. Вероятными причинами возникновения этих циркадных и цирканнуальных ритмов являются изменения метаболизма токсического вещества в организме (хронотоксикокинетика) и изменение восприимчивости токсического вещества органом-мишенью (хронотоксикодинамика) [22]. По-видимому, суточные и сезонные ритмы чувствительности к невысокой дозе ЭХГ являются функцией энзимной активности ферментов печени. Об этом свидетельствуют увеличение активности цитохром Р-450-редуктазы [25], НАДФН-цитохром-с-редуктазы [20] и глютатион-S-трансферазы [19] в печени крыс и мышей в темное и снижение в светлое время суток, пик продолжительности гексобарбиталового сна в 14 ч с минимумом в 20 ч [27]. Известный факт, что в утренние часы отмечается наибольшая активность синтеза ДНК и митотического процесса, может объяснить увеличение количества мембран эндоплазматического ретикулума и ферментных белков в 20 ч и уменьшение его в 14 ч [27]. Подтверждением зависимости сезонных ритмов чувствительности к невысоким дозам ЭХГ от активности соответствующих энзимов печени является снижение содержания цитохрома Р-450 в мембранах эндоплазматического ретикулума печени крыс-самцов, скорости N-деметилирования аминопирина и этилморфина в зимний период по сравнению с летним, а также уменьшение скорости гидроксилирования анилина в осенний сезон [8]. При расшифровке природы циркадных и цирканнуальных колебаний оказалось, что роль внутреннего осциллятора у млекопитающих принадлежит супрахиазматическим ядрам гипоталамуса и эпифизу [24]. Супрахиазматические ядра богаты нейронами и образуют множественные связанные между собой колебательные системы, что в комплексе создает циркадный осцилятор [26]. В эпифизе, помимо циркадных ритмов, имеются также и другие виды ритмов, в том числе недельные и особенно выраженные сезонные ритмы. Установлено, что активность эпифиза повышается в зимнее время по сравнению с летним периодом. Одной из причин развития сезонных ритмов может быть взаимодействие сезонных фотопериодических колебаний с нейроэндокринными репродуктивными изменениями [29]. Согласно имеющимся в литературе данным, в нормальных условиях ритмы генерируются "часами" основного осцилятора, передаются нервным или гуморальным путем к рецепторам, обусловливающим ритмическое освобождение цАМФ, который регулирует проведение нервных импульсов [21] и, на наш взгляд, активность ферментов печени, принимающих участие в метаболизме ЭХГ и других эпоксидных соединений [6]. Как уже отмечалось, при введении смертельных доз ЭХГ максимальная чувствительность к нему фиксировалась в ночные часы и летнее время. Это явление не согласуется с суточным и сезонным повышением активности ферментов детоксикации в печени [8, 19, 20, 25, 27]. Учитывая то, что ЭХГ в высоких концентрациях и дозах оказывает выраженное токсическое действие на центральную нервную систему [16], можно предположить, что мозговая ткань сама имеет ритм чувствительности к ЭХГ, независимый от ритма активности ферментов, метаболизирующих данный галоидуглеводород. Это предположение подтверждается и тем, что ингибируемая ионами Са2+ аденилатциклазная активность стриатума головного мозга крыс подвержена суточным циклическим ритмам [18]. Таким образом, токсичность ЭХГ зависит как от специфичности повреждающего действия, так и от уровня сопротивляемости циркадной и цирканнуальной систем (хронорезистентности) организма в данный временной период ее существования именно к этому воздействию. Приведенные в настоящей статье результаты исследований иллюстрируют практическое значение хронобиологических методов в токсикологических экспериментах. Это предполагает стандартизацию времени суток и сезона года когда осуществляют определение ЛД50 и других параметров токсикометрии и подтверждает ранее высказанное мнение [12] о важности учета циклических процессов при оценке опасности вредных факторов и их гигиеническом нормировании. Выводы 1. Токсичность ЭХГ в значительной степени зависит от суточных и сезонных биологических ритмов. 2. При воздействии ЭХГ в невысоких дозах (1/10 ЛД50) максимальная реакция к нему отмечается в 10—14 ч и в зимний сезон, а при использовании смертельных доз — в 22—02 ч и в летнее время. Минимальная восприимчивость к ЭХГ, применяемого в дозе 1/10 ЛД50, наблюдается в 18—02 ч и в летне-осенний период, а в дозе ЛД50 — в 10—14 ч и зимой. 3. Чувствительность к ЭХГ в дозе, составляющей 1/10 ЛД50, отстоит от дозы чувствительности к ЛД50 при изучении суточных ритмов на 12 ч, а сезонных — приблизительно на 180 дней. Литература |