УДК 613.2/.3:632.95

А.П. Кравчук, к.м.н., Е.Л. Костик, Д.С. Пигида, Л.В. Ермолова, И.В. Лепешкин, к.м.н.

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ ЯБЛОК И ЯБЛОЧНОГО СОКА В ТЕСТЕ НА ИНДУКЦИЮ ОБРАТНЫХ ГЕННЫХ МУТАЦИЙ У S. TYPHIMURIUM В ПРОЦЕССЕ РЕГЛАМЕНТАЦИИ НОВЫХ ХЛОРНИКОТИНИЛОВЫХ ИНСЕКТИЦИДОВ

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя, г. Киев

В Украине в 2002 г. было зарегистировано 50 инсектицидов, из них 16 синтетических пиретроидов (32%), 13 фосфорорганических соединений (ФОС) (26%), 21 представитель других химических классов (42%) [8].

Однако высокая токсичность ФОС и возникшая резистентность вредителей к синтетическим пиретроидам привели к разработке и внедрению представителей нового класса химических соединений — хлорникотинилов.

По химической структуре хлорникотиниловые инсектициды являются производными хлорпиридила и хлортиазолила. Хлорникотиниловые инсектициды характеризуются выраженной селективностью, широким спектром действия, высокой биологической эффективностью при меньших нормах расхода и кратности применения, являются малотоксичными и менее стойкими в объектах окружающей среды по сравнению с традиционно применяемыми инсектицидами [9].

Механизм действия этих веществ связан с взаимодействием с ацетилхолиновыми рецепторами постсинаптической мембраны, ведущим к развитию у насекомых конвульсий и параличей с последующей их гибелью.

Представителями хлорникотиниловых инсектицидов являются Конфидор, 20% в.р.к. и Калипсо, 48% к.с., фирмы "Байер" (Германия). По параметрам острой токсичности препаративные формы относятся к умеренно опасным и малоопасным веществам. При субхроническом и хроническом воздействии действующих веществ характерным является общетоксическое действие с преимущественно гепатотоксическим эффектом. Некоторые препараты проявляют слабую мутагенную активность.

Мутагенная активность имидаклоприда и тиаклоприда изучалась специалистами фирмы "Байер". Установлено, что имидаклоприд обладает слабой мутагенной активностью в 2 цитогенетических тестах in vitro. В тестах по исследованию влияния на ДНК, на индукцию генных мутаций, в цитогенетических тестах in vivo, мутагенная активность тиаклоприда не была выявлена.

С целью научного обоснования безопасных уровней содержания новых хлорникотиниловых инсектицидов в продуктах питания и непрямой оценки мутагенного фона, который будет формироваться с внедрением этих пестицидов в сельское хозяйство Украины [6], нами было проведено исследование содержания остаточных количеств имидаклоприда, тиаклоприда и мутагенной активности пищевых продуктов (на примере яблок и яблочного сока) в тесте Эймса.

Материалы и методы исследования

Изучали мутагенную активность экстрактов яблок и яблочного сока, полученных в период сбора урожая после применения хлорникотиниловых инсектицидов Конфидор, 20% в.р.к. (действующее вещество имидаклоприд) и Калипсо, 48% к.с. (действующее вещество тиаклоприд) фирмы "Байер" на яблоне и соответствующих контрольных образцах, полученных без применения пестицидов [7, 14]. Норма расхода препарата Конфидор составляла 0,3 л/га, 4-кратно, Калипсо — 0,3 л/га, 3-кратно.

Исследование содержания остаточных количеств имидаклоприда и тиаклоприда в яблоках, яблочном соке и контрольных образцах было проведено методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с методическими указаниями [11—13]. Пределы определения имидаклоприда и тиаклоприда составляли в яблоках — 0,025—0,07 мг/кг (ВЭЖХ, ТСХ), в яблочном соке — 0,01—0,06 мг/кг (ВЭЖХ, ТСХ).

В эксперименте по изучению мутагенной активности использовали тестерные штаммы S.typhimurium ТА-98 и ТА-100. Наличие мутагенного эффекта учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину.

Экстракцию имидаклоприда и тиаклоприда из яблок и яблочного сока проводили в соответствии с методическими указаниями [11—13].

Экстракты исследовали в нативной дозе и в дозе 1/2 от нативной, для чего разводили нативный раствор стерильной дистиллированной водой. Экстракты вносили по 0,1 мл на чашку Петри, то есть в дозах 50 и 100 мкл/чашку.

Эксперимент проводили в двух параллельных вариантах — без метаболической активации и с активацией микросомальной активирующей смесью S-9 mix, и сопровождали модельные мутагены контрольными вариантами, а также контролями растворителя — хлороформа.

В положительных контрольных вариантах использовали классические мутагены (табл. 1).

В контролях растворителя вместо экстрактов в чашки Петри вносили по 0,1 мл хлороформа, то есть по 100 мкл/чашку.

В контрольных вариантах эксперимента использовали по 5 чашек Петри, в опытных вариантах и в контролях растворителя — по 3 чашки. По результатам подсчета устанавливали среднее количество ревертантных колоний (М) и среднеквадратическое отклонение (m). Статистическую обработку проводили по [5].

В положительных контролях и в контролях растворителя за мутагенный эффект принимали превышение количества ревертантных колоний при инкубации бактерии вместе с классическими мутагенами или растворителем (М_о) не менее чем в 5 раз (с заданной вероятностью b₁=0,95) по сравнению со спонтанными уровнями реверсий (М_к), в опытных вариантах эксперимента за мутагенный эффект принимали превышение количества ревертантных колоний при инкубации бактерии вместе с экстрактами (М_о) не менее чем в 5 раз по сравнению с контролями растворителя (М_к) [2, 3].

Результаты и их обсуждение

После применения препаратов Конфидор, 20% в.р.к. и Калипсо, 48% к.с. на яблонях, остаточные количества имидаклоприда и тиаклоприда в плодах и яблочном соке в период сбора урожая методами ТСХ и ВЭЖХ не были обнаружены [10].

Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 2, 3, 4, 5, 6, экстракты яблок и яблочного сока в дозах 50 и 100 мкл/чашку в экспериментах с и без метаболической активации не индуцировали превышения количества ревертантных колоний s.typhimurium тестерных штаммов ТА-98 и ТА-100 — по сравнению с контролями растворителя.

В то же время, при использовании классических мутагенов (положительные контроли) было получено достоверное (p<0,05) превышение количества ревертантных колоний по сравнению со спонтанными уровнями реверсий, что указывает на адекватность использования данной тест-системы для исследования мутагенных свойств химических веществ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии мутагенных свойств у исследуемых экстрактов.

Заключение

В тесте Эймса Salmonella/микросомы не установлено мутагенной активности экстрактов яблок и яблочного сока, полученных в период сбора урожая после применения хлорникотиниловых инсектицидов Конфидор, 20% в.р.к. и Калипсо, 48% к.с. при их воздействии на тестерные штаммы S.typhimurium ТА-98 и ТА-100 в дозах 50 и 100 мкл/чашку в экспериментах с и без метаболической активации.

Результаты натурных исследований содержания остаточных количеств имидаклоприда и тиаклоприда в яблоках и яблочном соке, а также исследования мутагенной активности экстрактов яблок и яблочного сока в тесте Эймса после применения препаратов Конфидор, 20% в.р.к., Калипсо, 48% к.с. на яблонях, позволяют использовать для осуществления санитарного контроля рекомендованные ранее величины максимально допустимых уровней — МДУ [10] без ограничений. При правильном применении препаратов Конфидор, 20% в.р.к. и Калипсо, 48% к.с. яблоки и яблочный сок, полученные с их использованием, не будут представлять генетической опасности для человека.

Литература
1. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методические указания / М., 1985.
2. Ames B.N., McCann Y., Yamasaki E. Methods for detection Carcinogens s Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome mutagenicity test. // Mut. Res. —1975. —V. 31. —P. 347-364.
3. Maron D.M., Ames B.N. Revised for the Salmonella mutagenicity test. // Mut. Res. —1983. —V. 113. —P. 172-215.
4. Lowry O.N., Roserbrough N.J., Fart A.L. and Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. —1951. —V. 193. —P. 265-275.
5. Плохинский Н.А. Биометрия / М., 1970. —С. 9-35.
6. Кравчук О.П. Принципові підходи до гігієнічного регламентування пестицидів з урахуванням їх мутагенної активності. Матеріали науково-практичної конференції "Актуальні проблеми екогігієни і токсикології". —Київ, 1998. —Ч. 1. —С. 136-142.
7. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. —Киев, 1988.
8. "Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні". —Киев, 2001. —С. 31-50.
9. Ермолова Л.В., Лепешкин И.В. Сравнительная токсиколого-гигеническая характеристика представителей некоторых классов инсектицидов, зарегистрированных в Украине. Актуальные проблемы токсикологии. Тезисы докладов. —Киев, 1999. —С. 38.
10. Ермолова Л.В. Сравнительная токсиколого-гигиеническая характеристика поведения новых хлорникотинилсодержащих инсектицидов в сельскохозяйственных культурах // Современные проблемы токсикологии. —2000. —№5. —С. 15-19.
11. Методические указания по определению имидаклоприда в яблоках, сливах и винограде методом тонкослойной хроматографии. №135-99 от 02.02.99.
12. Методические указания по определению имидаклоприда в виноградном, сливовом и яблочном соках хроматографическими методами. №182-2000 от 13.01.2000.
13. Методические указания по определению тиаклоприда в воде, почве, яблоках и яблочном соке хроматографическими методами. №265-2001 от 05.02.2001.
14. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов / М.: МЗ СССР, 1980.