ЛІКУВАННЯ ІНТОКСИКАЦІЙ

УДК 615.9+615.099.08

П.Г. Жмінько, к.б.н., Ю.І. Лобода, д.б.н.

ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ЦИКЛОФОСФАНУ ПРИ ДІЇ НЕЙРОПАРАЛІТИЧНИХ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя, Київ

Вперше віддалена нейротоксична дія (ВНД) фосфорорганічних речовин (ФОР) була виявлена при отруєнні людей триортокрезилфосфатом (ТОКФ) та міпафоксом в першій половині XX століття. При отруєнні даними речовинами спостерігались демієлінізація нервових волокон і паралічі. В подальшому у людей було зареєстровано більше 30 тисяч випадків парезів і паралічів після вживання ямайського джина та оливкової олії. Причиною тому було те, що в даних продуктах містився ТОКФ. Насьогодні також зустрічаються випадки ураження нервової системи у людей внаслідок використання ФОР у промисловості, сільському господарсті, побуті [1—3].

Нейротоксичність властива ФОР, які в своїй структурі мають 2,2-дихлорвінільну групу, а також О-алкилфенілтиофосфонатам [4]. Механізм ВНД ФОР ще недостатньо з'ясований. Встановлено, що основним в патогенезі ВНД є фосфорилювання білка, який відноситься до карбоксилестераз — "нейротоксичної" b-естерази (НТЕ) [5]. Рaнніми проявами нейропатій, крім інгібування НТЕ, також є гальмування швидкості розповсюдження збудливості по периферичним нервам та зниження aмплітуди потенціала дії нерва, які проявляються до виникнення клінічних ознак ВНД [6].

На даний час можна вважати, що фосфорилювання НТЕ і подальше надзвичайно швидке старіння цього ферменту виконують роль тригера, який запускає цілий каскад біохімічних і імунологічних процесів, що призводить до дегенеративних змін в аксонах і демієлінізації [7].

Терапія ВНД насьогодні ще недостатньо розроблена. Використання специфічних засобів терапії ФОР — четвертичних реактиваторів холінестерази (ХЕ) і холінолітиків не попереджало виникнення нейротоксичного синдрому (парезів, паралічів, демієлінізації), а лише зменшувало холінергічні симптоми інтоксикації. Застосування в комплексній терапії атропіну і оксимних реактиваторів ХЕ при отруєнні ТОКФ, міпафоксом і дихлофосом тільки лише послаблювало перебіг нейропатій [3, 8].

Для лікування нейропатій також запропоновано поєднане застосування центрального реактиватора ХЕ диетиксима і індуктора монооксигеназної системи фенобарбітала [8]. Відомо, що диетиксим реактивує фосфорильовану ХЕ і дефосфорилює НТЕ в центральній і периферичній нервовій системі, що зменшує токсичні прояви ФОР. Фенобарбітал індукує монооксигеназну систему печінки, що призводить до посилення метаболізму ФОР і їх детоксикації. Однак, застосування фенобарбіталу при дії речовин, які метаболізують з утворенням нейротоксичних метаболітів, не може бути ефективним, а навпаки, тільки збільшить нейропаралітичну дію ФОР.

Позитивний ефект при лікуванні ВНД також може бути досягненний за допомогою гормонотерапії, зокрема метилпреднізолону. Однак, застосовані гормональні препарати повністю не попереджали виникнення парезів і паралічів [9].

В зв'язку з цим, пошук засобів лікування і профілактики ускладнень нейропатій, викликаних ФОР, насьогодні залишається надзвичайно актуальною проблемою.

Враховуючи те, що в патогенезі ВНД важливе значення має порушення аутоімунних процесів, а саме: утворення циркулюючих середньо- та мілкодисперсних імунних комплексів, аутоантитіл до нервової тканини, зміна кількісного складу та дисфункція імунокомпетентних клітин, в першу чергу Т-хелперів (Тх) і Т-супресорів (Тс) [10], нами проведене експериментальне дослідження ефективності відомого імунодепресанта циклофосфана з метою профілактики парезів і паралічів при дії деяких ФОР.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження ВНД проведені на курках породи Легорн, масою тіла 1,5—1,7 кг, як найбільш чутливому видi тварин щодо впливу нейропаралітичних ФОР. Для відтворення ВНД використані класичні нейропаралітичні речовини — ТОКФ і О,О-дифеніл-1-ацетокси-2,2,2-трихлоретилфосфонат (афос).

Імунодепресивний ефект у курок досягали за допомогою імунодепресанта циклофосфана. Вибір циклофосфанової моделі імунодепресивного стану тварин базується на тому, що, по-перше, він ефективний при лікуванні демієлінізуючих захворювань, зокрема розсіяного склерозу; по-друге, він пригнічує активність всіх клонів імунокомпетентних клітин — В-лімфоцитів, Т-хелперних і Т-супресорних лімфоцитів, попередників ефекторних клітин. Основна імунодепресивна дія його опосередкована прямою супресією на Т-хелперні лімфоцити [11, 12].

Для досягнення помірного імунодепресивного ефекту циклофосфан вводили по розробленій нами схемі: спочатку напротязі 3-х днів проводили премедикацію циклофосфаном (препарат вводили кожний день одноразово внутрішньом'язово в дозі 20 мг/кг), на 4 день перорально вводили досліджувані ФОР. Через 3 дні після введення ФОР знову вводили внутрішьном'язово циклофосфан одноразово в дозі 20 мг/кг на протязі 3 діб.

Нейротоксичну дію афосу досліджували при одноразовому пероральному введенні в дозах 100 мг/кг (доза, яка викликає слабкі ознаки ВНД) та 200 мг/кг (доза, яка спричиняє парези і паралічі). ТОКФ досліджували тільки в дозі 250 мг/кг, яка чинить виражену нейротоксичну дію.

Спостереження за тваринами проводили впродовж 42 днів. Вказаний термін досліджень обумовлений тим, що при дії класичних нейропаралітичних ФОР розвиток паралічів спостерігається уже на 21 добу, тому для визначення ефективності циклофосфану цей термін був збільшений у 2 рази.

В динаміці проводили клінічне обстеження тварин, визначали час появи та вираженість клінічних ознак ВНД, як у лікованих циклофосфаном, так і нелікованих курок.

Оскільки у розвитку ВНД імунологічні зміни мають важливе патогенетичне і прогностичне значення, то на 21 добу стан імунної системи лікованих тварин оцінювали за гематологічними і імунологічними показниками. Вірогідність змін досліджених показників курок, що отримували афос в дозі 200 мг/кг, надана по відношенню до фонових величин даної групи тварин. Крім того, на цій же групі тварин досліджені зміни імунної реактивності організму курок після премедикації циклофосфаном, що дає змогу визначити ступінь його імунодепресивного єфекту на початку моделювання ВНД. При дії ТОКФ в дозі 250 мг/кг вірогідність змін вивчаємих показників надана по відношенню до контрольної групи тварин.

Визначення загальної кількості лейкоцитів та підрахунок форменних елементів крові проводили за допомогою загальноприйнятих методів [13]. Кількість природних кілерів (NK-клітин), які відповідають за імунологічний нагляд в організмі, визначали за ультраструктурою лімфоцитів (великих базофільних гранулоцитів) [14]. Кількість Т-, В- і 0-лімфоцитів визначали за активністю кислої фосфатази (КФ) [15], яка локалізована в лізосомах цих клітин, кількість регуляторних субпопуляцій Т-лімфоцитів — Тх і Тс — за активністю кислої неспецифічної естерази (КНЕ) [16]. Функціональну активність Т-лімфоцитів вивчали за допомогою реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) периферичної крові із фітогемагглютинином (ФГА) [17]. Функціональну активність В-лімфоцитів оцінювали за титром гетерофільних гемагглютининів (ГГА) у сироватці крові, який визначали за допомогою реакції Пауля-Бунеля [18]. Отримані результати статистично обробляли на мікро-ЭВМ [19].

Результати та їх обговорення

Після перорального введенення куркам афоса в дозі 100 мг/кг (без застосування циклофосфана) латентний період ВНД становив 13 діб. Починаючи з 14 доби у курок відмічались легкі ознаки нейропаралітичної дії — м'язова слабкість, адинамія, порушення координації рухів, які проходили через 2—3 тижні.

При надходженні афосу в дозі 100 мг/кг в організм курок, які отримували циклофосфан по описаній вище схемі, клінічних ознак ВНД не спостерігалось на протязі всього періоду досліджень.

Афос, введений інтактним куркам в дозі 200 мг/кг, чинив виражену нейротоксичну дію. Латентний період становив 6 діб. На 7 добу після надходження афосу у 4 із 6 курок виявлена адинамія, м'язова слабкість; на 14 добу клінічні симптоми ВНД спостерігались у всіх курок (м'язова слабкість, адинамія, порушення координації рухів, атаксія). Через 17—20 діб у всіх тварин відмічались парези ніг, на 21—22 добу в 5 курок розвинулись паралічі, одна курка загинула, інші курки знаходились в стадії параліча до кінця експерименту.

При дії афосу в дозі 200 мг/кг у курок, які отримували циклофосфан, збільшувався латентний період в 3 рази, а клінічні ознаки нейропаралітичної дії були виражені в меншому ступені, ніж у нелікованих тварин.

Так, перші клінічні ознаки ВНД у лікованих курок з'являлись на 19 добу після введення афосу і характеризувались м'язовою слабкістю, незначним порушенням координації рухів. На 25 добу у 2-х курок із 6-ти розвинулась атаксія, на 40—42 добу в 4-х курок спостерігалась м'язова слабкість, атаксія, порушення координації рухів, у 2 курок клінічних ознак ВНД не выявлено. За весь час експерименту парезів і паралічів не встановлено.

Як видно із табл. 1, після премедикації циклофосфан викликав помірний лейкоцитоз, вірогідні абсолютний і відносний нейтрофільоз та моноцитоз, відносну лімфоцитопенію. Спостерігалось вірогідне збільшення відносної кількості Т-лімфоцитів на 17,2%, зменшення відносної і абсолютної кількості В-лімфоцитів на 63 і 64,8%, відповідно. Співвідношення субпопуляцій Т-лімфоцитів не змінювалось, але відносна кількість Тх була вірогідно зменшена на 20%. Крім того, спостерігалось зменшення абсолютної кількості Тс (на 20%) і nk-клітин (на 36,5%) по відношенню до фонових показників, але ці зміни не мали вірогідності. Функціональна активність Т-лімфоцитів (визначена за реакцією РБТЛ з ФГА) і В-лімфоцитів (визначена за титром ГГА у сироватці крові) була вірогідно знижена на 87,3 і 78,6%, відповідно.

Результати досліджень свідчать про те, що циклофосфан (після премедикації у сумарній дозі 60 мг/кг) чинить помірний імунодепресивний ефект.

При дії афоса в дозі 200 мг/кг на фоні циклофосфана (на 21 добу) спостерігались вірогідні відносний нейтрофільоз і абсолютний моноцитоз. Змін кількості В-, Т- і 0-лімфоцитів не відбувалось. Виявлено також вірогідне зменшення відносної кількості Тх (на 20,3%) і збільшення Тс (на 41,1%), коефіцієнт співвідношення Тх/Тс становив 1,16.

Функціональна активність Т- і В-лімфоцитів була знижена відносно фонових показників на 53,2 і 28,3%, по відношенню до циклофосфана вона збільшувалась на 268,2 та 234%, відповідно.

Як видно з наведених даних, при дії афоса на 21 добу у лікованих курок спостерігається імунодепресивний ефект, але менш виражений, ніж після премедикації циклофосфаном. Ознаки ВНД під дією афоса у лікованих курок з'являлись на 19 діб пізніше і були виражені в меншій мірі, ніж у курок, які не отримували циклофосфан. Цей факт вказує на те, що імунодепресант циклофосфан послаблює нейротоксичну дію афоса в дозі 200 мг/кг і запобігає розвитку ВНД у курок при дії афоса в дозі 100 мг/кг.

Позитивний ефект циклофосфана також можна простежити, якщо співставити зміни імунокомпетентних клітин периферичної крові нелікованих курок в паралітичній стадії і лікованих курок при дії афоса в дозі 200 мг/кг (рис. 1). Дані щодо кількісного складу імунокомпетентних клітин нелікованих курок при дії афоса в дозі 200 мг/кг наведені за роботою [10].

Як видно із рис. 1, у лікованих циклофосфаном курок зниження абсолютної кількості імунокомпетентних клітин периферичної крові було виражено в меншій мірі, ніж у нелікованих курок: лімфоцитів на 15%, NK-клітин на 47%, В-лімфоцитів на 13,8%, Т-лімфоцитів на 18,9% та збільшення кількості Тс на 66,9%. Крім того (рис. 2), спостерігалось значне гальмування функціональної активності Т- і В-лімфоцитів (на 58,2 і 59,1%, відповідно).

Таким чином, застосування циклофосфану зменшує диспропорцію кількісного складу імунокомпетентних клітин, збільшує кількість Тс і знижує функціональну активність Т- і В-лімфоцитів, що гальмує розвиток аутоімунних порушень в організмі курок і виникнення парезів і паралічів, зумовлених дією афосу.

Проведені аналогічні дослідження з ТОКФ показали, що препарат в дозі 250 мг/кг, введений інтактним куркам, викликав виражену клініку ВНД. Перші ознаки ВНД виявлені на 10—14 добу (адинамія, м'язова слабкість, порушення координації рухів). На 21 добу розвинулись виражена атаксія і парези у всіх курок, паралічів і загибелі тварин не спостерігалось. Вказані ознаки ВНД зберігались до кінця досліду.

При дії ТОКФ в дозі 250 мг/кг у курок, лікованих циклофосфаном, збільшувався латентний період на 14 діб, симптоми ВНД були виражені в меншому ступені, ніж у курок, які отримували тільки ТОКФ. Слабкі парези розвинулись у 2 із 6 курок тільки на 42 добу досліджень.

Результати досліджень показників стану імунної системи курок при дії ТОКФ надані в табл. 2.

Як видно із табл. 2, при дії ТОКФ у лікованих курок на 21 добу змін морфологічного складу периферичної крові не виявлено, за винятком вірогідного збільшення відносної кількості базофілів. Спостерігався також нейтрофільоз, але виявлені зміни не були вірогідними.

Установлено вірогідні відносне і абсолютне зменшення кількості NК-клітин (на 43,7 і 47,8%, відповідно), відносне збільшення Т-лімфоцитів (на 7,1%), Тх (на 14,8%) і зменшення Тс (на 31,4%). Коефіцієнт Тх/Тс становив 3,79, що вказує на можливість аутоімунних порушень в організмі тварин.

Функціональна активність Т-лімфоцитів була вірогідно зменшена на 41,2%, В-лімфоцитів на 66,7%.

Отримані результати свідчать, про те, що циклофосфан віддаляє і послаблює клініку ВНД, викликану ТОКФ, але в меншій мірі, ніж при дії афосу. Це може бути пов'язано з деякими відмінностями в дії досліджених ФОР на імунний статус організму курок.

Таким чином, в експерименті на найбільш чутливому виді тварин до дії нейропаралітичних ФОР показано, що циклофосфан є ефективним засобом для корекції ВНД, викликаної класичними нейротоксикантами — афосом і ТОКФ.

Виходячи з патогенезу ВНД, в якому важлива роль відводиться імунній системі, та з механізму імунодепресивної дії циклофосфану, можна припустити, що його ефективність полягає в пригніченні активності імунокомпетентних клітин, що, в свою чергу, гальмує розвиток аутоімунних порушень в організмі тварин і таким чином запобігає розвитку парезів і паралічів.

Слід зазначити, що фармакологічний ефект циклофосфану залежить від дози нейротоксиканту. Так, при дії афосу в дозі 100 мг/кг циклофосфан повністю попереджав розвиток ВНД, в більших дозах ФОР (афоса — 200 мг/кг, ТОКФ — 250 мг/кг) — віддаляв виникнення і послабляв перебіг патологічного процесу.

Література
1. Inoue N., Fujishiro K., Movi K., Matsuoka M. Triorthocresyl phosphate poisoning. A review of human cases // J. UOEM. —1988. —V. 10, —N4. —P. 433-442.
2. Калоянова Ф.П. Токсикология фосфорорганических пестицидов // Профилактическая токсикология. Сб. учебно-метод. материалов / Под. ред. Н.Ф. Измерова. —Том 2, часть 1. —МРПТХВ, Центр международных проектов. —М., —1984. —С. 250-271.
3. Кокшарева Н.В., Каган. Ю.С., Ткаченко И.И. Проблема отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических пестицидов (обзор) // Гиг. и сан. —1990. —№2. —С. 62-67.
4. Махаева Г.Ф., Малыгин В.В., Мартынов И.В. Отставленная нейротоксичность при действии фосфорорганических пестицидов // Агрохимия. —1987. —№12. —С. 103-124.
5. Johnson M.K. Improved assay of neurotoxic esterase for screening organophosphates for delayed neurotoxicity potential // Arch. Toxicol. —1977. —N37. —P. 113-115.
6. Tkachenko I.I., Kokshareva N.V., Kagan Yu.S. et al. A study of the delayed neurotoxic effect of a new organophosphorous fungicide 0,0-diphenyl-1-acetoxy-2,2,2-trichlorethylphosphonate (aphos). Communication 2. Electrophysiological and morpholodical investigations // Fresenius Env. Bul. —1993. —N2. —P. 131-136.
7. Махаева Г.A., Филоненко И.В., Малыгин В.В., Мартынов И.В. Близкая чувствительность нейротоксической эстеразы мозга крыс и кур к действию О-алкил-0-алкилхлормиминофенил-фосфонатов // Доклады Академии Наук. —1993. —Т. 333, №5. —С. 650-653.
8. Кокшарева Н.В. Механизм нейротоксического действия фосфорорганических и карбаматных пестицидов, обоснование основных принципов комплексной терапии отравлений. Автореф. дис. д-ра мед. наук: 14.00.20 / К., 1985. —48 с.
9. Baker T., Stanek A. Methylprednisolone treatmen of an organophosphorus —induced delayed neuropathy // Toxicol. and appl. Pharmacol. —1985. —V. 79, N2. —P. 348-352.
10. Жминько П.Г. Роль иммунной системы в патогенезе отдаленной нейротоксичности некоторых фосфорорганических соединений // Современные проблемы токсикологии. —1999. —№4. —С. 18-24.
11. Наполов Ю.К., Борисов К.Б. Иммунодепресанты, применяемые при патологии иммунной системы. I. Циклоспорин, циклофосфан, азатиоприн, меркаптопурин // Фармакол. и токсикол. —1991. —Т. 54, №4. —С. 80-87.
12. Леонтьева Т.И., Гладкова Н.Е., Утешев Б.С. Исследование иммунотропной активности циклофосфана // Фармакол. и токсикол. —1988.- Т. LI, №6. —С. 60-65.
13. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред В.В. Меньшикова. —М.: Медицина, 1982. —576 с.
14. Киндзельский Л.П., Бутенко А.К., Афанасьева В.В. и др. Определение количества естественных клеток-киллеров (БГЛ) // Вопросы онкологии. —1986. —№6. —С. 86-87.
15. Кисляк Н.С., Ленская Р.В. Клетки крови у детей в норме и патологии. —М.: Медицина, 1971. —176 с.
16. Mueller J., Bran Del Re G., Buerki H. Non-specific acid esterase activity: a criterion for differentiation of T- and B-lymphocytes in mous lymph nodes // Europ. J. Immunol. —1975. —N5. —P. 270-274.
17. Болотников И.А., Конопатов Ю.В. Физиолого-биохимические основы иммунитета сельскохозяйственных птиц. —Л.: Изд. "Наука", Ленинградское отделение, 1987. —С. 132-134.
18. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике. —Киев: Здоров'я, 1978. —С. 20-21.
19. Шевченко А.М., Богорад В.С., Яворовский А.П. Программированная обработка результатов токсиколого-гигиенических экспериментов на микро-ЭВМ типа "Электроника Б3-34" / Методические рекомендации. —Киев: Изд. Киевского мединститута, 1987. —22 с.


| Зміст |