ЛІКАРСЬКА ТОКСИКОЛОГІЯ

УДК 613.63:615.277.3

М.Я. Кудря, к.б.н., Л.В. Могилат, А.І. Гладкова, д.б.н., Н.В. Устенко, Н.В. Мельниківська

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ДАНІ ЩОДО ТОКСИКОЛОГІЇ ПРОТИПУХЛИННОГО ЗАСОБУ ЕСТРАЗИН

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данилевського АМН України, м. Харків

Прогресуюче збільшення кількості лікарських засобів, а також сполук, що використовуються для їх синтезу, ставить перед наукою та практикою завдання щодо попередження несприятливого впливу потенційно шкідливих та часто біологічно надзвичайно активних речовин на організм працюючих у відповідних виробництвах. Особливо це стосується протипухлинних засобів, адже в теперішній час в усіх країнах світу відмічається збільшення випадків захворювання та смертності від злоякісних пухлин. Отже пошук та впровадження у виробництво нових високоефективних протипухлинних препаратів є одним з гострих питань сьогодення.

Естразин (3-окси-естра-1,3,5(10)-трієн-17-гідразон) — нова біологічно активна сполука естрогенного ряду, яка призначена для лікування раку передміхурової залози, що є найбільш поширеним онкологічним захворюванням чоловіків похилого віку. Для естразину характерна тривала гормональна та протипухлинна дія. Тривають клінічні випробування даного лікарського засобу, планується його промислове виробництво.

Для випуску нового препарату та впровадження його в практику охорони здоров'я потрібне проведення ще на етапі проектування відповідного виробництва токсиколого-гігієнічних досліджень. У зв'язку з цим, метою даної роботи було вивчення особливостей токсичної дії естразину при різній тривалості впливу та різних шляхах надходження до організму.

Матеріали та методи дослідження

Експерименти поставлені на статевозрілих нелінійних білих щурах, білих мишах, кролях породи Шиншила та морських свинках, які утримувались на стандартному харчовому раціоні [1].

Параметри гострої токсичності визначали за методом [2] на щурах та мишах обох статей при пероральному та внутрішньоочеревинному введенні сполуки у кісточковій олії натще.

Для сполук естрогенного ряду характерна виражена здатність до шкірної резорбції. Шкірно-резорбтивну дію естразину досліджували згідно з методичними вказівками [3] з урахуванням показників функціонального стану репродуктивної системи [4]. Щурам-самицям на протязі 20 днів наносили на ділянку оголеної шкіри розміром 4х4 см сполуку в дозі 100 мг/кг. Естральний цикл вивчали за змінами цитологічної картини вагінальних мазків. Вивчення стану гонадотропної функції гіпофізу проводили методом біологічного тестування на інфантильних щурах-самицях. Концентрацію статевих гормонів в периферійній крові (прогестерона та естрадіола) визначали радіоімунологічним методом за допомогою відповідних комерційних наборів. Щурам-самцям естразин наносили на шкіру на протязі 15 діб в дозі 20 мг/кг. Оцінювали коефіцієнти маси статевих органів та функціональний стан сперматозоїдів [4].

Дослідження місцевої дії естразину на слизову оболонку ока кролів проводили в динаміці у відповідності з методичними вказівками [5].

Підгостру токсичність вивчали на 24 щурах-самицях в умовах 30-разового перорального введення естразину в дозі 500 мг/кг. В динаміці досліджували морфологічний склад периферійної крові, фактори гемокоагуляції, функціональний стан печінки, нирок, серцево-судинної системи та центральної нервової системи. По закінченні експерименту тварин під наркозом декапітували, їх внутрішні органи піддавали макроскопічному та гістологічному дослідженню.

Експерименти по встановленню Limac естразину проводили на щурах-самцях в умовах чотирьохгодинного інгаляційного отруєння в камерах конструкції Боярчука з такими режимами концентрацій: (11,9±1,8) мг/м3, (3,6±1,0) мг/м3 та (0,83±0,11) мг/м3. Ступінь пошкоджуючої дії сполуки при інгаляційному введенні оцінювали за результатами впливу на генеративну функцію щурів [4]. Визначали коефіцієнти маси сім'яників, сім'яних міхурців, передміхурової залози, концентрацію сперматозоїдів, час їх рухомості, мертві та патологічні форми. Також враховували вплив сполуки на функціональний стан центральної нервової системи.

Вивчення алергізуючої дії естразину проводили згідно методичним рекомендаціям [6] на морських свинках в умовах внутрішньошкірної та комбінованої сенсибілізації.

Можливу мутагенну дію вивчали методом реєстрації хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку щурів-самців на стадії метафази в умовах одноразового перорального введення естразину в дозі 1000 мг/кг [7].

Експериментальні дані оброблено статистично за критерієм Ст'юдента [8].

Результати та їх обговорення

Середньосмертельна доза (DL50) при пероральному введенні щурам та мишам обох статей перевищує 5100 мг/кг маси тіла, при внутрішньоочеревинному введенні — більше 1010 мг/кг, що дозволило віднести естразин до малотоксичних та малонебезпечних сполук (ІV клас небезпечності згідно ГОСТ 12.1.007-76). Клінічна картина отруєння тварин супроводжувалась здибленністю хутра, адинамією, відмовою від їжі. Через дві доби їх поведінка та зовнішній вигляд не відрізнялись від інтактних.

Дослідження місцево-подразнюючої дії естразину показало, що сполука не викликає змін у стані слизової оболонки ока ні в перші години після внесення, ні на протязі 10 наступних діб спостереження.

При вивченні шкірно-резорбтивної дії естразину на щурах-самицях доведено, що сполука здатна проникати через непошкоджену шкіру, впливаючи при цьому на стан периферійної крові, функції печінки та інші показники (табл. 1).

Поряд з цим зафіксовано негативний вплив естразину на генеративну функцію самиць. Так, кількість нормально циклюючих щурів-самиць зменшувалась до 45% у досліді, при 87% у контролі. У тварин простежені зміни як тривалості, так і фазової структури естрального циклу (табл. 2). Також естразин здатний пригнічувати гонадотропну функцію гіпофизу, про що свідчить зниження у порівнянні з контролем коефіцієнту маси матково-яєчникового комплекса у інфантильних щурів-самиць, які отримували гіпофізарну емульсію від піддослідних тварин. Дослідження гістоструктури яєчників та матки після нашкірних аплікацій естразину свідчать про виразний естрогенізуючий ефект сполуки на органи жіночої репродуктивної системи. В яєчниках відмічається як зростання кількості овоцитів, котрі вступають у стадію росту, так і їх атрезія: спостерігається велика кількість фолікулів із загиблими овоцитами. На місцях таких фолікулів формуються атретичні тіла. В матці зафіксовано виразне збудження секреторного епітелію та розростання секреторних залоз в товщу складчастого ендометрію; секреторна активність залоз дуже виразна.

Естразин при нанесенні на шкіру негативно впливає на генеративну функцію щурів-самців. При цьому вірогідно зменшуються коефіцієнти маси сім'яників до 4,93±0,59 при 14,90±1,59 в контролі, сім'яних міхурців (контроль — 1,79±0,21, дослід — 0,80±0,05) та передміхурової залози. Кількість щурів з азооспермією досягла 67%. З боку функціонального стану сперматозоїдів зафіксовано вірогідне зниження їх загальної кількості, збільшення кількості мертвих (контроль — 8,9±2,5, дослід — 85,0±4,2) та патологічних форм, скорочення часу рухомості. Гістологічні дослідження сім'яників свідчать про значне пригнічення сперматогенезу, ендокринна функція сім'яників теж знижена. Субхронічне пероральне введення естразину чинить гемотоксичний ефект. Зокрема, у тварин виявлено вірогідне зниження рівня загального (контроль — 121,2±10,9 г/л, дослід — 93,7±5,6 г/л) та оксигемоглобіну, зменшення кількості еритроцитів на протязі всього експерименту (після 5 затравлень: у контролі — (6,0±0,3)•1012/л при (4,7±0,2)•1012/л у досліді; після 25 затравлень: контроль — (6,6±0,3)•1012/л, дослід — (5,1±0,2)•1012/л). В мазках крові місцями зустрічались гіпохромні еритроцити. На протязі експерименту була зафіксована наявність тілець Гейнца, що свідчить про деструктивні зміни молекули гемоглобіну. Тривале введення даної сполуки викликало у щурів статистично значуще зниження рівня холестерину від 4,22±0,34 ммоль/л у контролі до 2,71±0,07 ммоль/л у досліді, зміни емоційного стану, збільшення коефіцієнтів маси печінки (контроль — 35,8±1,5, дослід — 61,7±4,3), серця, гіпофізу (контроль — 0,07±0,01, дослід — 0,15±0,03), підшлункової залози, матки (контроль — 3,0±0,1, дослід — 5,5±0,4).

При гістологічному дослідженні внутрішніх органів піддослідних тварин встановлено, що в серці мали місце слабо виражені явища кардіоміопатії.

В печінці спостерігали помірно або слабо виражені явища гепатоза. Гепатоцити центральної зони збільшені, набряклі, синусоїдні простори розширені. Гепатоцити проміжної та периферійної зон — в стані помірно або слабо вираженої жирової дистрофії. Простежені дрібні вогнища некрозу та поліморфізм ядер гепатоцитів.

Нирки піддослідних тварин у порівнянні з контролем значно збільшені, набряклі. Клубочки збільшені, судинні петлі щільно прилягають одна до одної. Відмічені проліферація та злущування клітин ендотелія.

При дослідженні шлунку спостерігали серозний гастрит. Шлункові ямки виражені слабо. Строма слизової та підслизової основи дуже розволокнена серозною рідиною. У кишечнику відмічено серозний ентерит. Строма ворсинок та підслизової основи розволокнена. Мала місце вогнищева інфільтрація сегментоядерними лейкоцитами та лімфоцитами. Спостерігали атрофію ворсинок, стовпчатих та бокаловидних клітин.

У піддослідних тварин, на відміну від контролю, відмічено різке збільшення обсягу надниркових залоз за рахунок кіркової речовини. Товщина кіркової речовини збільшена за рахунок пучкової зони, клітини якої різко збільшені в обсязі, вакуолізовані, відмічається порушення їх колончатої будови. В клубочковій зоні клітини різко вакуолізовані, часто поруйновані.

В кірковій речовині яєчників простежено перевагу зростаючих та порожнинних фолікулів. Великі фолікули утворюють сецернуючі серозні кісти, однокамерні або багатокамерні. Внутрішня поверхня кіст гладка з епітеліальною вистілкою, яка подібна епітелію маткових труб.

Вивчення можливих мутагенних властивостей естразину показало, що як в досліді, так і в контролі зустрічається однаковий спектр хромосомних порушень: окремі та парні фрагменти, обміни хроматидного типу. Кількість клітин з хромосомними абераціями в кістковому мозку піддослідних щурів 1,63±0,40% статистично не відрізняється від контролю — 1,00±0,30%.

Результати дослідження потенційних алергенних властивостей естразину свідчать, що він не викликає у піддослідних тварин стану гіперчутливості.

В умовах інгаляційного надходження до організму естразин впливав на функціональний стан репродуктивної системи щурів-самців. На рівні всіх випробуваних концентрацій сполука призводила до дозозалежного зниження часу рухомості сперматозоїдів (рисунок). При концентрації 11,9 мг/м3 зафіксоване статистично значуще зменшення коефіцієнту маси сім'яних міхурців.

При надходженні до організму естразину в концентрації 3,6 мг/м3 відмічено зміни функціонального стану ЦНС у вигляді статистично значущого збільшення сумаційно-порогового показника.

За критерієм впливу на генеративну функцію пороговою визнана концентрація естразину 0,83 мг/м3.

Клінічна картина гострого інгаляційного отруєння тварин характеризувалась незначною загальмованістю, адинамією, в'ялістю.

Результати проведених досліджень дозволили розрахувати величину ОБРВ для естразину з використанням параметрів токсикометрії, мінімальної діючої терапевтичної дози та вищої діючої добової дози.

Проте слід відмітити, що наявність естразину у повітрі навіть у дуже малих концентраціях є дуже небезпечною. Для прикладу наведемо розрахунки. Умовно терапевтична доза естразину для щурів дорівнює 20 мг/кг [9], а поглинута доза на рівні Limac складає 0,07 мг/кг, тобто майже в 300 разів менше. Однак при цьому зафіксовано вплив сполуки на генеративну функцію. На рівні токсичних концентрацій естразину 11,9 та 3,6 мг/м3 поглинуті дози становлять 1 мг/кг та 0,32 мг/кг, що в 20 та майже в 70 разів нижче умовно терапевтичної, відповідно. Однак на фоні цих концентрацій у тварин відмічені значні зміни показників генеративної функції та інтегральних показників. Отримані результати свідчать про потенційну небезпечність естразину при інгаляційному надходженні навіть у дозах, які набагато менші за умовно терапевтичну.

Враховуючи вищевказане, пропонуємо гігієнічне регламентування естразину у повітрі робочої зони за принципом виключення будь-якого контакту із сполукою в умовах виробництва.

Висновки

1. За критерієм гострої токсичності (DL50) естразин відноситься до малотоксичних та малонебезпечних сполук.

2. Найбільш чутливі та патогенетично обумовлені критерії шкідливості даної сполуки є показники впливу на генеративну функцію.

3. Гігієнічне регламентування пропонуємо у вигляді повного виключення наявності естразину в повітрі робочої зони.

Література
1. Западнюк М.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте. —К.: Вища школа, 1983. —383 с.
2. Прозоровский В.В., Прозоровская Н.П., Демченко В.Н. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология. —1978. —№4 —С. 497-504.
3. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование допустимых уровней загрязнения кожи. Метод. указания. —М., 1980. —№2102-79.
4. Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Метод. рекомендации / М-во здравоохранения СССР. —М., 1978. —35 с.
5. Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию ПДК избирательно действующих веществ в воздухе рабочей зоны. —М. —№2196-80.
6. Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно-допустимых концентраций химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосфере. Метод. указания. —М., 1993.
7. Оценка мутагенности новых лекарственных средств. Метод. рекомендации / М-во здравоохранения СССР. —М., 1987. —56 с.
8. Гланц С. Медико-биологическая статистика (Пер с англ.) —М.: Практика, 1998. —459 с.
9. Эстразин —новый противоопухолевый препарат адресованного действия / З.С. Смирнова, Н.Д. Лагова, В.И. Киселев и др. // Вестник ОНЦ АМН России. —1996. —№3. —С. 24-27.


| Зміст |