УДК 545.224.4:591.3:616.007:615.099:622

А.П. Кравчук, к.м.н., Ю.Н. Максимов, д.м.н., Т.И. Григорьєва, к.м.н., В.Ф. Даниленко, к.фарм.н., И.В. Болтина, Е.Л. Костик, Д.С. Пигида

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА АМИЗОН

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя
Институт фармакологии и токсикологии, г. Киев

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) находят широкое применение в клинике инфекционных болезней как средства патогенетической терапии при состояниях, сопровождающихся чрезмерной лихорадочной реакцией, интенсивным воспалением, выраженным болевым синдромом. Однако большинство из этих средств проявляют и нежелательные побочные эффекты: раздражающее влияние на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, угнетающее воздействие на костномозговое кроветворение и картину периферической крови с развитием лейкопении и анемии. Указанных побочных реакций в значительной степени лишен новый отечественный препарат амизон — средство с противовирусными, обезболивающими, противовоспалительными, жаропонижающими и иммуномодулирующими свойствами [1].

Препарат малотоксичен, но его мутагенные свойства изучены недостаточно, что и явилось целью данных исследований.

При выполнении работы были использованы следующие методы: тест на индукцию генных мутаций у Salmonella typhimurium (тест Эймса), тест на индукцию аберраций хромосом лимфоцитов периферической крови человека in vitro.

Изучение мутагенной активности Амизона в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro

Изучали цитотоксическое действие, мутагенную активность без метаболической активации и мутагенную активность с метаболической активацией.

Материалы и методы исследования

Лимфоциты культивировали по методу Хангерфорда [2] на протяжении 52 ч с модификациями [3], что позволяло исследовать клетки первого митоза. В эксперименте использовали культуру лимфоцитов, полученную от практически здорового донора — женщины 36 лет, которая не принимала медицинских препаратов и не проходила в течение года рентгенологических исследований. Отбор метафазных пластинок для цитогенетического анализа, классификация и метод подсчета аберраций хромосом были общепринятыми [4, 5]. Для цитогенетического анализа использовали метафазные пластинки без перекреста хромосом, которые содержали 46±2 хромосомы. Учитывали аберрации хроматидного и хромосомного типов. Пробелы отмечали, но в число аберраций не включали. Проводили анализ зашифрованных препаратов, окрашенных рутинным методом. В каждой концентрации анализировали не менее 100 метафаз. Статистическую обработку проводили согласно критериям Стьюдента на компьютере по пакету программ Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Цитотоксическое действие

При действии амизона в концентрациях 2500, 250 и 25 мкг/мл отмечено снижение митотической активности, что не позволило набрать количество клеток, необходимых для анализа. В двух других концентрациях (2,5 и 0,25 мкг/мл) препарат не индуцировал статистически достоверного увеличения колличества аберраций хромосом по сравнению с контролем (табл. 1).

При действии на культуру лимфоцитов сильного мутагена прямого действия Митомицина-Ц, который использовался в качестве положительного контроля, установлено достоверное повышение частоты аберраций, что подтверждает адекватность применения данной тест-системы для изучения цитогенетической активности химических мутагенов.

Итак, выявлены цитотоксические концентрации препарата амизон в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro.

Эксперимент без метаболической активации

Ни в одной из исследуемых концентраций препарат не индуцировал статистически достоверное увеличение частоты аберраций хромосом (табл. 2).

Аберрации хромосом представлены одиночными, парными фрагментами и обменами. И хотя спектр смещен в сторону аберраций хроматидного типа, но преобладание фрагментов (и одиночных, и парных) может быть объяснено действием факторов химической природы [6, 7].

Итак, препарат амизон не проявляет мутагенной активности в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro без метаболической активации.

Оценка генетического риска зависит от объема знаний метаболизма исследуемых соединений в организме животных и человека, от факторов, которые влияют на этот процесс, а также от полноты изучения его генетического потенциала. Большинство мутагенов находится в окружающей среде в виде промутагенов. Для того, чтобы под воздействием этих соединений возникла мутация, необходим ферментативный процесс — их метаболическая активация, которая в организме проходит с помощью ферментов. Поэтому, для более детальной оценки генетического риска вещества с неизвестным мутагенным действием проводится эксперимент с метаболической активацией.

Микросомальную фракцию печени крыс для активации готовили согласно рекомендациям [8].

Ни в одной из исследуемых концентраций препарат не индуцировал статистически достоверного увеличения количества хромосом по сравнению с уровнем контрольной культуры S-9. Но в концентрациях 0,25 и 0,025 мкг/мл было отмечено снижение митотической активности.

Аберрации хромосом представлены одиночными и парными фрагментами. Обмены найдены лишь в двух наивысших концентрациях. При действии циклофосфана, который использовался в качестве положительного контроля, установлено достоверное повышение частоты аберраций хромосом и смещение спектра аберраций в сторону образования аберраций хроматидного типа (табл. 2), что подтверждает адекватность применения данной тест-системы для изучения цитогенетической активности химических веществ.

Итак, препарат Амизон не проявляет мутагенной активности в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro без и с метаболической активацией.

Изучение мутагенной активности Амизона в тесте на индукцию генных мутаций у S.typhimurium (тест Эймса)

Сущность метода заключается в регистрации способности исследуемого вещества и/или его метаболитов индуцировать реверс-мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у тестерных штаммов бактерий S.thyphimurium, несущих his--мутации и не способных синтезировать гистидин. Для образования возможных метаболитов исследуемое вещество подвергают процессу биотрансформации с помощью ферментов микросомального окисления, содержащихся в постмитохондриальном супернатанте гомогената печени крыс — фракции S-9. Для этого бактерии S.thyphimurium инкубируют вместе с исследуемым веществом, а также микросомальной активирующей смесью — S-9 mix (фракция S-9+Ко-факторы: НАДФ и глюкозо-6-фосфат).

Эксперимент проводят в двух параллельных вариантах — без метаболической активации и с активацией. В вариантах без метаболической активации регистрируют действие прямых мутагенов — соединений, индуцирующих мутации за счет активности исходной структуры исследуемого вещества. Действие же промутагенов — соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, регистрируют в вариантах эксперимента с активацией.

С целью выявления разных типов мутаций в эксперименте использовали два тестерных штамма S.typhimurium: ТА-98 (his D 3052, rfa, Duvr b, +R), который регистрирует мутации по типу сдвига рамки считывания, и ТА-100 (his G 46, rfa, Duvr b, +R), который регистрирует мутации по типу замены пар оснований. Наличие мутагенного эффекта учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину. Соответствие каждого бактериального штамма своему генотипу и характерный спонтанный уровень реверс-мутаций определяли по методике [8].

Микросомальную фракцию гомогената печени крыс готовили по методическим рекомендациям [8]. Содержание белка [9] в микросомальной фракции было 20,6 мг/мл.

Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные среды и работа с бактериальными культурами соответствовали методическим указаниям [8, 10-12].

Вначале определяли токсические концентрации амизона на штамме S.typhimurium ТА-100 без метаболической активации. Рабочие растворы готовили на стерильной дистиллированной воде непосредственно перед использованием и вносили по 0,1 мл/чашку Петри в концентрациях 2500, 250, 25, 2,5 и 0,25 мкг амизона/0,1 мл раствора. Суспензию бактерий вносили по 0,1 мл/чашку Петри (концентрация бактерий в суспензии составляла около 1000/0,1 мл). После 24-часового инкубирования бактерий на полной питательной среде подсчитывали количество колоний. Эксперимент на определение бактериотоксичности амизона проводили в двух повторностях (использовали по 2 чашки Петри). Определяли среднее количество колоний и среднеквадратичное отклонение. Полученные данные представлены в табл. 3.

Амизон ни в одной из концентраций не оказывал статистически достоверного токсического влияния на бактерии тестерного штамма ТА-100.

Эксперимент по изучению мутагенной активности амизона проводили в двух параллельных вариантах — без метаболической активации и с активацией микросомальной активирующей смесью S-9 mix, и сопровождали отрицательными и положительными контрольными вариантами. Рабочие растворы амизона готовили так же, как и в эксперименте по определению бактериотоксичности, и вносили по 0,1 мл/чашку Петри в концентрациях 2500, 250, 25, 2,5 и 0,25 мкг/0,1 мл раствора.

Варианты эксперимента без метаболической активации

В опытных вариантах эксперимента в пробирки с агаром вносили по 0,1 мл раствора амизона в указанных концентрациях и по 0,1 мл суспензии бактерий (концентрация бактерий в суспензии составляла 1—2•10⁹/0,1 мл). Учет ревертантных колоний проводили после 48 ч инкубации в термостате (+37 °С).

В отрицательных контрольных вариантах эксперимента (спонтанный уровень реверсий) в пробирки с "верхним" агаром вносили только по 0,1 мл суспензии бактерий.

В положительных контрольных вариантах эксперимента (мутаген-индуцированный уровень реверсий) в пробирки с агаром вносили по 0,1 мл растворов мутагенов [8, 10]: дауномицина (6 мкг/чашку) — для штамма S.typhimurium ТА-98 и азида натрия (1,5 мкг/чашку) — для штамма ТА-100. Растворы мутагенов готовили непосредственно перед внесением на стерильной дистиллированной воде. В остальном компоненты и последовательность их внесения были такие же, как и при инкубировании бактерии с амизоном.

Варианты эксперимента с метаболической активацией

В опытных вариантах эксперимента в пробирки с агаром вносили по 0,1 мл раствора амизона в указанных концентрациях, по 0,4 мл смеси:

раствор MgCl₂/KСl — 1,2 мл,
1 М глюкозо-6-фосфат (Sigma) — 0,3 мл,
0,1 М NADF (Sigma) — 2,4 мл,
0,2 M фосфатный буфер (рН=7,4) — 30,0 мл,
стерильная дистиллированная вода — 14,1 мл,

по 0,1 мл микросомальной фракции S-9 (разведенной стерильной дистиллированной водой 1/1) и по 0,1 мл суспензии бактерий. Учет ревертантных колоний проводили после 48 ч инкубации в термостате (+37 °С).

В отрицательных контрольных вариантах эксперимента в пробирки с агаром вносили по 0,5 мл микросомальной активирующей смеси S-9 mix и по 0,1 мл суспензии бактерий.

В положительных контрольных вариантах эксперимента вместо раствора амизона в пробирки с агаром вносили по 0,1 мл растворов мутагенов [8, 10]: 2-аминофлуорена (10 мкг/чашку) — для штамма S.typhimurium ТА-98 и циклофосфана (100 мкг/чашку) — для штамма ТА-100. Циклофосфан растворяли в стерильной дистиллированной воде, а 2-аминофлуорен — в диметилсульфоксиде. Растворы мутагенов готовили непосредственно перед внесением их в пробирки с агаром.

В контрольных вариантах эксперимента использовали по 5 чашек Петри (5 повторностей), в опытных — по 3 чашки Петри (3 повторности). Количество ревертантных колоний в опытных вариантах эксперимента учитывали только при наличии мутагенного эффекта в положительных контролях (мутагенный эффект в положительных контролях свидетельствует о способности данной тест-системы выявлять мутагенные свойства химических веществ). По результатам подсчета количества ревертантных колоний на каждой из трех (или пяти) тестерных чашек определяли среднее количество ревертантов и среднеквадратичное отклонение.

Из данных табл. 4 следует, что амизон в концентрациях от 0,25 до 2500 мкг/чашку в экспериментах с и без метаболической активации не индуцирует статистически достоверное увеличение количества ревертантных колоний s.typhimurium тестерных штаммов ТА-98 и ТА-100 по сравнению со спонтанными уровнями реверсий (отрицательные контроли). Это свидетельствует об отсутствии мутагенных свойств у исследуемого вещества. В то же время при использовании классических мутагенов (положительные контроли) было получено статистически достоверное увеличение количества ревертантных колоний по сравнению со спонтанными уровнями реверсий, что указывает на адекватность использования данной тест-системи для изучения мутагенных свойств химических веществ.

Следовательно, в тесте Эймса Salmonella/микросомы при действии амизона в концентрациях от 0,25 до 2500 мкг/чашку на тестерные штаммы S.typhimurium ТА-98 и ТА-100 в экспериментах с и без метаболической активации мутагенной активности не выявлено.

Итак, амизон не проявляет мутагенной активности в тесте на индукцию аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro с и без метаболической активации и в тесте Эймса Salmonella/микросомы в экспериментах с и без метаболической активации.

Литература
1. Применение нового украинского препарата амизона в лечении и профилактике инфекционных болезней. Методические рекомендации // Киев, 2000. —71 с.
2. Hungerford D.A. Leucocytes cultured from small inocula of whole blood and preparation methaphase chromosomes by treatment with hypotic KCl // Stain Techn., 1965. —V. 40. —P. 333-338.
3. Болтина И.В., Кравчук О.П. Метод изучения мутагенной активности веществ (метафазного анализа аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека) in vitro с метаболической активацией. —2001. —ПА № 4301.
4. Evans H.J. Human perypheral blood lymphocytes for the analysis of chromosome aberrations in mutagen test. Handbook of mutagenicity test procedurs, second edition // Elsever Sci. Pub. —1984. V. 11. —P. 405-427.
5. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П. и др. Хромосомы человека. Атлас // М.: Медицина, 1982. —264 с.
6. Братівник Л.І. Оцінка мутагенної активності регуляторів росту рослин в культурі лімфоцитів людини. Тези доповіді ІІ з"їзду медичних генетиків України // Львів, 1995. —С. 24.
7. Пилинская М.А. Частота аберраций хромосом у работников теплиц и чувствительность их лимфоцитов in vitro к цитогенетическому действию диматифа. // Цитология и генетика. —1985. —Т. 19, №2. —С. 124-128.
8. Maron D.M., Ames B.N., Revised metods for the Salmonella mutagenicity test. // Mutat. Res. —1983. —V. 113. —P. 173-215.
9. Lowry O.N., Roserbrough N.J., Fart A.L. and Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. —1951. —V. 193. —P. 265-275.
10. Ames B.N., McCann Y., Yamasaki E. Methods for detection Carcinogens s Mutagens with the Salmonella / Mammalian Microsome mutagenicity test. // Mutat. Res. —1975. —V. 31. —P. 347-364.
11. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений. Итоги науки и техники. Токсикология. —М., 1986. —Т. 14. —С. 27-57.
12. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методические указания. —М., 1985.