ТОКСИЧНІСТЬ І АНТИХОЛІНЕСТЕРАЗНА ДІЯ ДЕЯКИХ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ ПЕСТИЦИДІВ У ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД ЇХ СОРБЦІЇ НА ПРОТЕЇНАХ СИРОВАТКИ КРОВІ

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, м. Київ

Відомо, що одним із місць втрат ксенобіотиків на шляху до біологічної мішені можуть бути протеїни сироватки крові (альбумін, імуноглобуліни, b-ліпопротеїди, a-глікопротеїди). Для більшості ксенобіотиків комплексоутворення з протеїнами має зворотний характер і розцінюється як форма детоксикації. В деяких випадках, наприклад для речовин алкіліруючого типу та сполук, які легко піддаються гідролізу, зв'язування з альбуміном підвищує їх токсичність [1].

На прикладі деяких динітрофенольних, фосфор- і хлорорганічних сполук показано, що молекула альбуміна має специфічні ділянки, які розпізнають присутність ліганда в оточуючому їх середовищі і запускають механізм конформаційного переходу білка, в результаті чого формуються основні центри для фіксації ксенобіотика. Різні за структурою сполуки можуть мати 1 або декілька місць звўязування на молекулі альбуміна [1, 2].

Показано також, що альбумін звўязує продукти перекисного окислення ліпідів як у здорових людей, так і у людей з різною патологією. В звўязку з цим, альбумін розглядають не тільки як основний транспортний білок, але і як один із антиоксидантних факторів, що лімітує перекисні процеси в організмі [3].

При деяких захворюваннях печінки, нирок, міхурової залози, серцево-судинної системи спостерігається зниження комплексоутворюючої здатності альбуміна, що негативно відбивається на біотрансформації ендогенних і екзогенних хімічних речовин і ускладнює перебіг патології [3—5].

Виходячи з даних літератури можна зробити висновок, що альбумін відіграє значну роль у біотрансформації і токсичності ксенобіотиків. В зв'язку з цим дослідження процесів сорбції ксенобіотиків, зокрема пестицидів, на протеїнах сироватки крові має важливе значення як для з'ясування механізмів їх токсичної і селективної дії, так і розробки детоксикаційної терапії.

Метою даної роботи було визначення ступеню зв'язування деяких фосфорорганічних пестицидів (ФОП) з білками сироватки крові різних видів тварин і людини. Оскільки для ФОП визначальним в їх біологічній дії є антихолінестеразний ефект, то важливим було дослідити залежність антихолінестеразної дії і токсичності від ступеню сорбції їх на білках.

Матеріали та методи дослідження

В експериментах використані ліофілізований альбумін сироватки крові людини (АСЛ) фірми "Reanal" (Угорщина), імуноглобуліни сироватки крові людини класу М (IgM) фірми Sigma (США) та цільна сироватка крові щурів, кролів, курок і людини. Дослідження ступеню зв'язування гетерофоса, етафоса, афоса, тіолового і тіонового ізомерів циклофоса проводили за методом рівноважного діаліза [6]. Концентрацію пестицидів у діалізній камері визначали методом газорідинної хроматографії спільно з к.х.н. М.В. Письменною.

Оскільки досліджувані речовини є інгібіторами холінестерази, то зв'язування з білками сироватки крові визначали також за ступенем інгібування активності холінестерази. Для цього готували розчини препаратів у фосфатному буфері рН 7,4 в концентраціях від 1•10^-2 до 1•10^-10 М. Інкубацію проводили як з альбуміном і IgM, так і без них. Активність холінестерази визначали за методом [7]. За отриманими даними розраховували концентрацію ФОП, яка викликала інгібування ферменту на 50% (I₅₀) та визначали ступінь змін активності ферменту в залежності від зв'язування речовин з протеїнами.

Результати та їх обговорення

За допомогою рівноважного діалізу встановлено, що ступінь зв'язування афоса, етафоса і гетерофоса з АСЛ становить 98,7%, 78,0%, і 30,9%, відповідно. Як видно з наведених даних, серед досліджених сполук афос має найбільш виражені властивості щодо утворення комплексу з альбуміном сироватки крові людини, ніж етафос і гетерофос.

Дані щодо зв'язування ФОП з білками сироватки крові різних видів тварин і людини (визначені методом рівноважного діаліза) надані в табл. 1.

Серед досліджених ФОП комплесоутворення з протеїнами сироватки крові, незалежно від виду ссавців, найбільш виражене у етафоса. За ступенем зв'язування з протеїнами сироватки крові досліджені ФОП розташовуються в такій послідовності: етафос, тіоловий ізомер циклофоса, гетерофос, тіоновий ізомер циклофоса.

Найбільший ступінь зв'язування етафоса з протеїнами сироватки крові виявлено у кролів і щурів, гетерофоса — у щурів. Для етафоса ступінь зв'язування з білками сироватки крові знижується в ряду — кролі, щури, людина, курки; гетерофоса — щури, кролі, людина, курки.

Відмінностей в зв'язуванні з протеїнами сироватки крові тіолового ізомера циклофосу для досліджених видів ссавців не встановлено. Тіоновий ізомер циклофоса практично не зв'язується з протеїнами сироватки крові — ступінь сорбції його на протеїнах становив від 0 до 6,8%. Цей факт може бути пояснений тим, що він характеризується вираженою ліпофільністю [8]. Спроможність його накопичуватись в жирових тканинах і зумовлює низьку токсичність для тварин (ЛД₅₀ для щурів — 3000 мг/кг).

Найбільш виражена видова відмінність в сорбції на білках характерна для гетерофоса. Так, в порівнянні з сорбцією на протеїнах сироватки крові щурів, ступінь сорбції гетерофоса на протеїнах сироватки крові курок був меншим на 47,8%, людини — 23,1%, кролів — 22,2%. Зменшення сорбції на протеїнах інших речовин (по відношенню до сорбції з білками сироватки крові кролів) було менш вираженим. У етафоса зменшення сорбції становило: для курок — 22,2%, людини — 14,0%, щурів — 6,9%; у тіолового ізомера циклофоса: для людини — 13,3%, курок — 1,6%, щурів 0,8%.

Величина гострої токсичності для щурів афоса, eтафоса, гетерофоса, циклофоса (суміш тіолового і тіонового ізомерів у співвідношенні 15:25) становить 3000, 350, 35 і 640 мг/кг; для курок — гетeрофоса, етафоса, циклофоса — 2, 20, 50 мг/кг, відповідно.

Як видно з наведених даних, гостра токсичність афоса для щурів в порівнянні з етафосом відрізняється приблизно на порядок, з гетерофосом — на 2 порядки, з циклофосом — в 4,7 разів. Порівнюючи гостру токсичність даних ФОП для щурів і спорідненість їх до АСЛ, можна зробити висновок, що їх токсичність залежить від ступеню сорбції на альбуміні.

Гостра токсичність гетерофоса і етафоса для курок, в порівняні з щурами, була вищою в 17,5, циклофоса — в 12,8 разів. Отже, зменшення сорбції вказаних речовин на протеїнах сироватки крові курок сприяє збільшенню їх токсичності.

Отримані дані свідчать про те, що зв'язування з білками сироватки крові досліджених ФОП сприяє зниженню їх токсичності для лабораторних тварин і може обумовлювати видову чутливість до дії ксенобіотиків.

Результати досліджень антихолінестеразної дії ФОП в залежності від сорбції на альбуміні і IgM сироватки крові людини надані в табл. 2.

За величиною pI₅₀ найбільшу антихолінестеразну дію по відношенню до чистої АХЕ еритроцитів людини має оксифосфонат. Антихолінестеразна активність досліджених речовин зменшується в ряду оксифосфонат, тіоловий ізомер циклофоса, етафос, гетерофос, афос.

При 30 хв інкубації речовин з АСЛ їх антихолінестеразна активність (по відношенню до чистої АХЕ еритроцитів людини) зменшувалась. Так сорбція оксифосфоната на АСЛ сприяла зменшенню його антихолінестеразної дії на 2,2; афоса на 2,05; етафоса — 1,6; тіолового ізомера циклофоса — 1,05, гетерофоса — 0,7 порядка. Це свідчить про те, що частина речовин сорбується на альбуміні в результаті чого знижується їх антихолінестеразна дія.

При інкубації речовин з IgM їх антихолінестаразна активність (по відношенню до чистої АХЕ людини) також зменшувалась, але в значно меншому ступені ніж після інкубації з АСЛ. Так, сорбція оксифосфоната на IgM сприяла зменшенню його антихолінестеразної дії на 0,5; афоса на 0,6; етафоса — 0,25; тіолового ізомера циклофоса — 0,25, гетерофоса — 0,2 порядка.

Отримані результати свідчать про те, що ФОП сорбуються як на альбуміні, так і на імуноглобулінах. По відношенню до АСЛ сорбція на IgM сироватки крові людини незначна.

Антихолінестеразні властивості ФОП в залежності від взаємодії їх з еритроцитами і протеїнами сироватки крові щурів надані в табл. 3.

Для етафоса, тіолового ізомера циклофоса і гетерофоса величини pI₅₀ АХЕ еритроцитів щурів були на рівні pI₅₀ для чистої АХЕ еритроцитів людини. Величини pI₅₀ АХЕ еритроцитів щурів у оксифосфоната і афоса знижувались, відповідно на 0,95 і 1,4 порядка. Цей факт вказує на те, що антихолінестеразна дія оксифосфоната і афоса виражена в більшій мірі по відношенню до АХЕ еритроцитів людини ніж щурів. Після попередньої інкубації оксифосфоната, афоса, тіолового ізомера циклофоса і гетерофоса з АСЛ антихолінестеразна дія їх щодо АХЕ еритроцитів щурів зменшувалась: у оксифосфоната на 2,4; афоса більше 2; етафоса — 1,55; тіолового ізомера циклофоса — 1,35, гетерофоса — 0,85 порядка. Інгібування АХЕ еритроцитів після сорбції афоса і оксифосфоната значно менше, ніж в попередніх дослідженнях, і цей факт може свідчити про те, що вони в більшому ступені, спроможні сорбуватись на мембранах еритроцитів, що, можливо, і є причиною їх менш вираженої антихолінестеразної дії.

Дослідження з сироваткою крові щурів показали, що антихолінестеразна активність ФОП по відношенню ХЕ сироватки крові щурів виражена в меншому ступені ніж АХЕ еритроцитів. Антихолінестеразний ефект був найбільшим у оксифосфоната (pI₅₀ = 4,5•10^-6) і зменшувався в ряду оксифосфонат, тіоловий ізомер циклофосу, етафос, гетерофос, афос.

Після сорбції досліджуваних ФОП на АСЛ антихолінестеразний ефект щодо ХЕ сироватки крові щурів зменшувався: у оксифосфоната на 2,35; афоса більше 3; етафоса — 1,85; тіолового ізомера циклофоса — 1,65, гетерофоса — 1,05 порядка, що свідчить про виражену сорбцію афоса і оксифосфоната на АСЛ. Найбільшу здатність щодо зв'язування з АСЛ мав афос, найменшу — гетерофос, шо узгоджується з даними, отриманими за допомогою рівноважного діаліза. Менш виражений антихолінестеразний ефект ФОП після інкубації їх з АСЛ і сироваткою крові щурів, ніж з АСЛ і АХЕ еритроцитів людини або АСЛ і еритроцитами щурів, можна пояснити додатковою сорбцією їх на протеїнах сироватки крові.

Таким чином, найбільшу здатність до сорбції на АСЛ і протеїнах сироватки крові щурів мають оксифосфонат, афос і етафос, найменшу гетерофос і тіоловий ізомер циклофоса. Із збільшенням сорбії на білках антихолінестеразний ефект зменшується. Тіоновий ізомер циклофоса практично не зв'язується з білками сироватки крові.

Для афоса, етафоса, циклофоса і гетерофоса виявлена залежність між гострою токсичністю і ступенем сорбції на білках. Це підтверджує положення про те, що сорбція на білках спрямована на детоксикацію хімічних речовин, оскільки зв'язування з протеїнами крові зменшує вільну концентрацію ксенобіотика, затримує його на периферії і зменшує як антихолінестеразний, так і токсичний ефект.

Література
1. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. —М.: Медицина, 1984. —224 с.
2. Лукьянчук В.Д. Связывание 2,4-динитрофенола сывороткой крови и ее белковыми фракциями // Журн. эксперим. и клин. мед. —1982. —№4. —С. 337—341.
3. Толкачева Н.В. Альбумин-зависимый транспорт низкомолекулярных лигандов при различных состояниях организма // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине (Под ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрецова). —М.: Ириус, 1994. —С. 135—141.
4. Метальникова Н.П., Громашевская Л.Л., Пономарев В.Л. и др. Связывающая способность альбумина как показатель эффективности средств и методов сорбционной детоксикации // Там же —С. 149—154.
5. Ландау М.А. Молекулярная природа отдельных физиологических процессов. —М.: Наука, 1985. —260 с.
6. Лукьянчук В.Д., Луйк А.И. Изучение обратимого взаимодействия пестицидов с белками сыворотки крови (Методические рекомендации) / Киев: МЗ СССР, ВНИИГИНТОКС, 1983. —29 с.
7. Hestrin S. The reaction of acethylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine and its biological application // J. Biol. Chem. —1949. —V. 180. —P. 249—261.
8. Жминько П.Г. Особенности биологического действия нового фосфорорганического инсектоакарицида циклофоса и его гигиеническая регламентация в воздухе рабочей зоны / Автореф. дис… канд. биол. наук: 14.00.07, Киев ВНИИГИНТОКС. 1988. —20 с.

| Зміст |