УДК 577.16:577.164.17:615.262

І.П. Гунько

ФОЛІЄВА КИСЛОТА ТА КОМПЛЕКС ВІТАМІНІВ А, Е, В₁, В₂, В₆, В₉ І СЕЛЕНУ ЯК ЗАСОБИ КОРЕКЦІЇ ТОКСИЧНИХ ЕФЕКТІВ МЕТОТРЕКСАТУ ТА ДИКЛОФЕНАКУ НАТРІЮ

Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова

В лікуванні хворих на ревматоїдний артрит (РА) препаратами вибору є засоби, здатні модифікувати перебіг захворювання, і серед них метотрексат, а нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП) залишились в арсеналі засобів симптоматичної терапії. Найбільш поширеною в клініці є комбінація метотрексату з НПЗП, однак її застосування підвищує ризик виникнення побічних ефектів [1—3]. Метотрексат та НПЗП мають спільні органи-мишені, зокрема кишечник та печінка [1, 3, 4], тому слід рахуватись з можливістю потенціювання їх токсичних ефектів.

Бажання звести до мінімуму побічні ефекти спонукає ревматологів знижувати дози включених до комбінації препаратів або призначати засоби супроводу. Так, застосування фолієвої кислоти дає можливість знизити важкість побічних ефектів метотрексату, хоча в цьому випадку необхідно враховувати можливість зменшення його терапевтичного ефекту [5—7]. Однак, в цілому проблема безпечності лікування РА задовільно не вирішена і тому питання пошуку засобів корекції побічних ефектів фармакотерапії залишається актуальним.

Метою роботи було оцінити здатність комплексу вітамінів А, Е, В₁, В₂, В₆, В₉ та селену протидіяти токсичним ефектам метотрексату та диклофенаку натрію на печінку та тонкий кишечник щурів.

Матеріали та методи дослідження

Досліди проведені на 60 білих щурах самцях та самках з початковою масою 100—130 г. Під час дослідів тварини перебували протягом 1 міс на напівсинтетичному раціоні, який забезпечує надходження оптимальних кількостей незамінних нутрієнтів. Раціон включав 20% казеїну, 65% крохмалю, 5% смальцю та 5% соняшникової олії, 3% суміші солей, 1% целюлози та всі вітаміни в необхідних для щурів кількостях [8].

В частині дослідів тваринам, які отримували повноцінний раціон, перорально вводили протягом 20 днів мікронутрієнти в дозах, що в 5—10 разів перевищують мінімальну добову потребу щурів в них. Тварини отримували фолієву кислоту в дозі 0,2 мг/кг або вітамінний комплекс: альфа-токоферол (20 мг/кг), ретинол (3000 МО/кг), тіамінбромід (5 мг/кг), рибофлавін (2 мг/кг), піридоксин (2 мг/кг), фолієва кислота (0,2 мг/кг). Враховуючи, що до складу сольової суміші не входить такий важливий мікроелемент як селен, а наявний вміст селену в казеїні повністю не покриває потребу тварин в ньому, ми вводили перорально щурам селеніт натрію в дозі 30 мкг/кг. Ця доза селену приблизно в 5 разів перевищує добову потребу щурів в селені і не викликає токсичних явищ [9].

Метотрексат та диклофенак натрію вводили перорально протягом останніх 20 днів перебування на напівсинтетичному раціоні в дозах 0,2 мг/кг та 2,5 мг/кг, відповідно.

Вміст ретинолу визначали флюорометричним методом, токоферолу — за реакцією Еммері-Енгеля [8], аскорбінової кислоти — мікрометодом з 2,6-дихлорфеноліндофенолом [10]. Забезпеченість тіаміном оцінювали за ступенем активації транскетолази в еритроцитах при додаванні тіаміндифосфату — ТДФ-ефект [8, 10]. Забезпеченість рибофлавіном визначали за ступенем активації глутатіонредуктази еритроцитів при додаванні коферменту ФАД — ФАД-ефект [8, 10]. Забезпеченість піридоксином оцінювали за ступенем активації аспартатамінотрансферази в еритроцитах при додаванні піридоксальфосфату — ПАЛФ-ефект [8, 10]. Кількість селену в сироватці крові визначали кінетичним методом [11]. Вміст гомоцистеїну, який є інтегральним показником статусу фолієвої кислоти, вітаміну В₁₂ та піридоксину визначали методом високоефективної рідинної хроматографії [12].

Вміст білку визначали мікробіуретовим методом, концентрацію фосфоліпідів — за утворенням гідрофобного комплексу з феротіоціанатом амонію [13]. Активність аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), гама-глутамілтрансферази визначали уніфікованими методами [14]. Активність сахарази та мальтази в гомогенаті слизової оболонки визначали за швидкістю вивільнення глюкози [15]. ДНК в гомогенаті визначали дифеніламіновим методом [16].

Результати та їх обговорення

Досліди показали, що 20-денне введення щурам метотрексату разом з диклофенаком натрію викликає токсичні явища, які проявляються у сповільненні росту тварин. Так, якщо у щурів контрольної групи за 30 днів маса тіла зросла на 32,6%, то у тварин, яким вводили метотрексат та диклофенак натрію, приріст маси склав лише 18%. Слід зауважити, що застосовані дози диклофенаку натрію та метотрексату вважаються терапевтичними і використовуються в експериментах для лікування ад'ювантного артриту. Додаткове введення тваринам фолату виявилось нездатним запобігти зменшенню росту щурів під впливом метотрексату та диклофенаку натрію — приріст маси тіла за 30 днів склав всього 17%. Лише призначення полівітамінного комплексу разом з селеном значною мірою нівелювало негативний вплив фармакотерапії. Приріст маси тіла щурів склав 23%.

Наявність захисного ефекту комплексу вітамінів та селену дозволяє припустити, що негативна дія метотрексату та диклофенаку натрію хоча б частково може бути обумовлена девітамінізуючим впливом фармакотерапії. Тому ми оцінили вплив цих препаратів на забезпеченість щурів деякими вітамінами (табл. 1). Призначення метотрексату та диклофенаку натрію тваринам привело до формування полівітамінної недостатності, яка проявилась істотним зниженням рівня токоферолу в сироватці крові та ретинолу в печінці і суттєвим зростанням величини ТДФ-, ФАД- та ПАЛФ-ефектів в еритроцитах та рівня гомоцистеїну в сироватці крові. Накопичення гомоцистеїну є опосередкованим свідченням дефіциту фолієвої кислоти — важливого чинника в перетворенні гомоцистеїну в метионін за участю ферменту метионінсинтетази, де в ролі кофактора виступає кобаламін [17]. Тому зростання рівня гомоцистеїну вказує на можливий дефіцит і вітаміну В₁₂. В реакції, яка каталізується за участю піридоксальфосфату, гомоцистеїн може перетворюватись в цистеїн. Тобто, рівень гомоцистеїну може відображати як дефіцит одного з вітамінів, причетних до його метаболізму, так і полівітамінну (В₆, В₉, В₁₂) недостатність. Таке значне, в порівнянні з інтактним контролем, зростання рівня гомоцистеїну, скоріш за все, відображає дефіцит усіх, причетних до його обміну вітамінів.

Додаткове призначення щурам фолату суттєво не змінювало девітамінізуючий вплив фармакотерапії щодо статусу ретинолу і токоферолу, однак дещо пом'якшувало її дію на статус тіаміну, рибофлавіну, піридоксину і приводило до зниження вмісту гомоцистеїну — інтегрального показника статусу фолату, вітамінів В₆ та В₁₂. Однак, лише вітамінно-селеновий комплекс виявився здатним майже в повній мірі компенсувати індуковану фармакотерапією втрату вітамінів.

Токсичний вплив метотрексату та диклофенаку натрію на організм щурів проявляється лейкопенією та зниженням маси тимусу (табл. 2). Якщо в контролі метотрексат та диклофенак натрію знижували вміст лейкоцитів в крові на 44%, а масу тимусу на 35%, то у тварин, які отримували фолієву кислоту, ці показники знижувалися на 36% та на 29%, відповідно, а у щурів, які отримували вітамінно-мікроелементний комплекс, на 27% та 26%, відповідно. Тобто призначення мікронутрієнтів повністю не усуває імуносупресивну дію метотрексату. Це важливо, оскільки в основі його лікувального дії при РА лежить імуносупресивний ефект, тому максимально зменшуючи побічні ефекти метотрексату потрібно зберегти його лікувальні властивості.

До інших клінічно значимих побічних ефектів метотрексату належить його гепатотоксична дія. Введення щурам метотрексату з диклофенаком натрію викликало істотне підвищення в сироватці крові активності АлАТ та АсАТ (в 2,44 та 2,35 рази). Введення щурам фолату дещо зменшувало гепатотоксичні ефекти фармакотерапії, однак максимальну захисну дію спостерігали при призначенні вітамінно-селенового комплексу. В цій групі тварин активність АлАТ зросла лише в 1,59 рази, тоді як в групі без додаткового призначенні вітамінів — в 2,44 рази. Аналогічним чином змінювалась і активність АсАТ. Тобто, вітамінний комплекс з додаванням селену ефективно запобігає токсичній дії метотрексату і диклофенаку натрію.

Поєднання метотрексату з диклофенаком натрію є найбільш вживаним варіантом терапії РА. Однак, таке поєднання є досить небезпечним, зокрема для кишечнику, який дуже чутливий, як до НПЗП, так і до метотрексату. Введення метотрексату і диклофенаку натрію викликає істотні зміні в складі слизовій оболонці кишечнику — вміст білку падає на 34%, ДНК — на 24%, фосфоліпідів — на 46%. Фолієва кислота зменшувала негативний вплив цих препаратів — вміст білку знижувався лише на 24%, ДНК на 15%, фосфоліпідів — на 35%. Максимальний ефект справляв комплекс вітамінів з селеном. У тварин цієї групи вміст білку зменьшився лише на 22%, ДНК — на 11%, фосфоліпідів — на 22%.

Введення щурам метотрексату та диклофенаку натрію істотно пригнічує активність сахарази та мальтази (на 50% та 53%) в слизовій оболонці кишечнику. Призначення тваринам фолату дещо зменшувало токсичний вплив цих засобів на кишечник: активність сахарази знижувалась на 37%, мальтази на 38%. Застосування комплексу вітамінів з селеном виявилось ще більш ефективним — активність сахарази знижувалась лише на 27%, а мальтази — на 25%.

Таким чином, наші дослідження показали, що фармакотерапія диклофенаком натрію та метотрексатом справляє негативний вплив на організм тварин. Відбувається виснаження запасів вітамінів в організмі, уповільнюється розвиток тварин, порушується функціональний стан печінки та кишечнику. Призначення щурам, що отримували метотрексат та диклофенак натрію, фолієвої кислоти частково запобігає розвитку токсичних наслідків фармакотерапії. Комплекс вітамінів та селену в більшій мірі, ніж фолієва кислота, запобігає негативному впливу метотрексату та диклофенаку натрію на організм щурів.

Висновки

1. 20-денне введення метотрексату та диклофенаку натрію гальмує ріст щурів, викликає лейкопенію, зменшення маси тимусу, пошкодження печінки та тонкого кишечнику, що проявляється зростанням активності сироваткових трансаміназ, зменшенням в слизовій оболонці вмісту білка, фосфоліпідів та ДНК, активності сахарази та мальтази.

2. Токсичний вплив метотрексату та диклофенаку натрію на організм щурів проявляється зниженням їх забезпеченості вітамінами А, Е, В₁, В₂, В₆, В₉, та В₁₂.

3. Призначення щурам фолієвої кислоти частково, а комплексу вітамінів та селену в значно більшій мірі послаблює негативний вплив фармакотерапії метотрексатом та диклофенаком натрію на організм щурів.

Література
1. Simon C.H., Dijkmans B.A., Breedveld F.C.Variations in the monitoring and management of the side effects of antirheumatic drugs by means of laboratory tests. // Clin. Exp. Rheumatol. —1997. —15, №6. —P. 633—639.
2. Nakazaki S., Murayama T., Katoh S. Cytopenia associated with low dose pulse methotrexate in the treatment of rheumatoid arthritis. // Ryumachi. —2001. —41, №6. —P. 929—937.
3. Coleiro B., Mallia C. Toxicity profile of methotrexate in rheumatoid arthritis. A preliminary survey. // Adv. Exp. Med. Biol. —1999. —455. —P. 359—365.
4. Straus W.L., Ofman J.J. Gastrointestinal toxicity associated with nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Epidemiologic and economic issues. // Gastroenterol Clin. North. Am. —2001. —30, №4. —P. 895—920.
5. Suzuki Y., Uehara R., Tajima C., Noguchi A., Ide M., Ichikawa Y., Mizushima Y. Elevation of serum hepatic aminotransferases during treatment of rheumatoid arthritis with low-dose methotrexate. Risk factors and response to folic acid // Scand. J. Rheumatol. —1999. —28, №5. —P. 273—281.
6. Bressolle F., Kinowski J.M., Morel J., Pouly B., Sany J., Combe B. Folic acid alters methotrexate availability in patients with rheumatoid arthritis. // J. Rheumatol. —2000. —27, №9. —P. 2110—2114.
7. Endresen G.K., Husby G. Folate supplementation during methotrexate treatment of patients with rheumatoid arthritis. An update and proposals for guidelines. // Scand. J. Rheumatol. —2001. —30, №3. —P. 129—134.
8. Экспериментальная витаминология / Под ред. Ю.М. Островского. —Минск: Наука и техника, 1979. —550 с.
9. Істошин В.М. Токоферол, селен та дибунол, як модулятори ферментних систем біотрансформації ксенобіотиків: Дис... канд. біол. наук: 03.00.04. —Вінниця, 1996. —177 c.
10. Спиричев В.Б. /ред/. Методы оценки и контроля витаминной обеспеченности населения / М.: Наука, 1984. —170 с.
11. Кинетический метод определения селена в биологическом материале / О.А.Ефременко, И.И.Краснюк, Б.А.Руденко и др.// Журн. aналитич. химии. —1985. —15, №11. —C. 2012—2016.
12. Пентюк О.О., Ільченко О.В., Шевчук С.В., Андрушко І.І., Данченко О.П. Визначення концентрації гомоцистеїну в біологічних рідинах методом високоефективної рідинної хроматографії. // Медична хімія 2001. —3, №3. —С. 61—68.
13. Определение фосфолипидов в биологическом материале по образованию гидрофобного комплекса с ферротиоцианатом аммония /А.А. Пентюк, В.И. Гуцол, О.А. Яковлева и др. // Лаб. дело. —1987. —Т. 6. —С. 21.
14. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник /Под ред. проф. В.В. Меньшикова. —М.: Медицина, 1987. —368 с.
15. Лукомская И.С. Определение активности дисахаридаз в слизистой кишечника человека. В кн. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1997. —С. 127—131.
16. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. —М.: Изд. МГУ, 1989. —508 с.
17. Selhub J. Homocysteine metabolism// Annu. Rev. Nutr. —1999. —19. —P. 217—246.