МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЇ

УДК 616-008.9-092.9:615.916'175

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В СЕМЕННИКАХ БЕЛЫХ КРЫС В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НИТРАТОМ НАТРИЯ

С.В. Денисенко, В.А. Костенко, к.м.н.

Украинская медицинская стоматологическая академия

Активация процессов свободно-радикального окисления считается важным механизмом, определяющим гонадотоксическое действие химических соединений [3, 4].

Спонтанная продукция активных форм кислорода тканями семенников и сперматозоидами поддерживается в норме на низком уровне антиоксидантной системой [5, 6]. При воздействии различных фармакологических и токсических агентов выработка кислородных радикалов может изменяться в широких пределах [4, 6].

В то же время источники продукции активных форм кислорода в семенниках млекопитающих при избыточном поступлении в организм нитратов изучены недостаточно.

Целью исследования было изучение продукции супероксидного анион-радикала микросомальной, митохондриальной и лейкоцитарной электронно-транспортными цепями в тканях семенников при хронической интоксикации нитратом натрия.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на 25 белых крысах-самцах линии Вистар в 5-ти сериях опытов. В первой серии исследуемые показатели изучали у интактных животных (контрольная серия); во второй, третьей, четвертой и пятой сериях — после введения нитрата натрия через зонд интрагастрально в дозе 200 мг/кг в течение соответственно 2-х недель, 1-го, 3-х и 6-ти месяцев. Белых крыс декапитировали под легким эфирным наркозом.

Образование супероксидного анион-радикала оценивали при проведении теста с нитросиним тетразолием (НСТ) [5]. При этом спектрофотометрическим НСТ-тестом оценивается продукция супероксида в гомогенате тканях семенников с индукторами НАДН, НАДФН и бактериальными липополисахаридами. Для этого 0,1 г ткани гомогенизировали в 0,9 мл изотонического (pH 7,4) фосфатного буфера. Отбирали по 0,05 мл гомогената в 4 пробирки (а, в, г, д). Добавляли в пробирки и перемешивали: а) 0,05 мл буферного раствора (для определения общей фоновой нестимулированной активности); б) 0,05 мл 3 % раствора НАДФН (для оценки продукции супероксидного анион-радикала микросомальной электронно-транспортной цепью); в) 0,05 мл 3 % раствора НАДН (для оценки продукции супероксидного анион-радикала митохондриальной электронно-транспортной цепью); г) 0,05 мл тритона Х—100 до конечной концентрации 0,1 %, взбалтывали 2 мин. Перемешивали и преинкубировали при 37 °С: 10 мин — пробирки "б" и "в", 30 мин — пробирки "а" и "г". В пробирку "г" добавляли 0,1 мл ампульного препарата бактериального липополисахарида (пирогенал) для оценки продукции супероксидного анион-радикала фагоцитами. Для этого добавляли по 0,05 мл НСТ на буфере, перемешивали. Инкубировали при 37 °С: "а" и "г" — 30 мин, "б" и "в" — 5 мин. Добавляли 2,0 мл растворителя (хлороформ и диметилсульфоксид в соотношении 1:2 по объему) и взбалтывали 1 мин. Центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Отбирали окрашенный надосадочный слой. Фотометрировали 1,0 мл верхнего слоя против соответствующего контроля при оптимальной длине волны 540 нм на микроФЭКе МКМФ-1 с ходом луча 0,5 см и объемом 1 мл. Контроль: набирали в 4 пробирки 0,05 мл буфера + 0,05 мл воды + 0,05 мл НСТ и добавляли в пробирки: а) 0,05 мл воды; б) 0,05 мл НАДФН; в) 0,05 мл НАДН; г) 0,05 мл тритона Х—10 + 0,1 мл пирогенала, инкубировали тоже 10 и 30 минут при 37 °С и также элюировали окраску. Сами НАДФН, НАДН, пирогенал не восстанавливают НСТ. Поскольку по реакции 1 моль НСТ восстанавливается 2 молями супероксидного анион-радикала, то для расчета строили стандартный график по экстинции диформазана (0,01-0,2 мл 0,2 % НСТ восстанавливали смесью 0,1 мл 0,1 н KOH и 0,1 мл раствора аскорбиновой кислоты (18 мг/10 мл)). Инкубировали, диформазан элюировали 2 мл растворителя и фотометрировали. Учитывая разведение, соотношение компонентов в реакции, экстинцию стандарта по графику проводили расчет:
для "а" и "г":
Е х 11,11 = нмоль/гoс;
для "б" и "в":
Е х 66,67 = нмоль/гoс

Полученные данные обработаны вариационно-статистическим методом с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Через 2 недели после начала введения в организм белых крыс нитрата натрия отмечается достоверное возрастание общего фона продукции супероксидного анион-радикала (см. таблицу) — на 36,1 % (p<0,05) и его выработки митохондриальной электронно-транспортной цепью (на 32,2 %, p<0,02).

Возрастание продукции супероксидного анион-радикала митохондриальной электронно-транспортной цепью (на 23,2 %, p<0,05) наблюдается и через 1 мес после начала введения в организм белых крыс нитрата натрия.

После 3-месячного введения нитрата натрия отмечается существенное повышение как общего фона продукции супероксидного анион-радикала (на 58,3 %, p<0,001) и его выработки митохондриальной электронно-транспортной цепью (на 41,1 %, p<0,01), так и возрастание продукции О2- микросомальной электронно-транспортной цепью (на 33,7 %, p<0,01). Выработка О2- при использовании в качестве стимулятора пирогенала, позволяющая оценить вклад НАДФН-оксидазной системы лейкоцитов в процесс продукции АФК [5], при исследовании на 14-е, 30-е и 90-е сут интоксикации нитратом натрия достоверно не отличается от данных контрольной серии.

После 6-месячного введения нитрата натрия рост общего фона продукции супероксидного анион-радикала, его выработки митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями нарастает и превышает данные контрольной серии соответственно на 69,4 % (p<0,01), 44,6 % (p<0,01) и 47,6 % (p<0,001). В отличие от более ранних сроков наблюдения, после 6-месячного введения нитрата натрия отмечается достоверное снижение (на 25,9 %, p<0,05) выработки О2- при использовании в качестве стимулятора пирогенала, что свидетельствует об ограничении в этот период функциональной активности НАДФН-оксидазы лейкоцитов.

Известно, что активация НАДФН-оксидазного комплекса в лейкоцитах требует ГТФ-связывающего белка Gox, причем для регенерации ГТФ необходим АТФ [1]. Ранее нами показано, что в динамике хронической интоксикации нитратом натрия в тканях семенников развивается тяжелая биоэнергетическая недостаточность [2], что может обуславливать ограничение функциональной активности электронно-транспортной цепи лейкоцитов.

Супероксидный анион-радикал, вырабатываемый митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями, а также другие образующиеся в динамике хронической нитратной интоксикации активные формы кислорода способны индуцировать и продолжать цепь свободно-радикального окисления [9, 10]. Следует отметить, что как супероксидный анион-радикал, так и гидроксильный и гидропероксильный радикалы могут образовываться в больших концентрациях в организме млекопитающих также при окислении нитратами и нитритами дезоксигемоглоглобина и миоглобина [7, 8].

Таким образом, в динамике хронической интоксикации нитратом натрия в тканях семенников белых крыс отмечается прогрессирующее увеличение общего фона продукции супероксидного анион-радикала и его выработки митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями. После 6-месячного введения нитрата натрия продукция супероксидного анион-радикала НАДФН-оксидазой лейкоцитов существенно снижается.

Литература
1. Глоба А.Г., Демидова В.С., Темяков В.Г. Синтез плазма-мембранного сигнального АТФ нейтрофилами, активированными формилпептидом, при клинической и экспериментальной инфекции; связь с продукцией супероксида // Биохимические проблемы хирургии. —М., 1991. —С. 222-232.
2. Денисенко С.В., Бондаренко В.В., Глебова Л.Ю. Влияние токсических доз нитратов на окислительные и энергетические процессы // Тези доп. І з'їзду Токсикологів України (Київ, 11-13 жовтня 2001 р.). —К., 2001. —С. 94-95.
3. Мудрый И.В., Петрова Р.П., Раецкая Е.В., Рыбчинская И.Я. Изучение эмбриотоксического и тератогенного воздействия сульфонала, свинца и нитратов на организм белых крыс при их раздельном и комбинированном введении // Гигиена и санитария. —1993. —№4. —С. 51-72.
4. Почерняева В.Ф. Експериментальне обгрунтування застосування антиоксидантів як гонадопротекторів: Автореф. дис. …д-ра мед.наук. —К.,1997. —40 с.
5. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофотомет-рическое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісн. Української мед. стоматол. академії. —2002. —Т.2, №1. —C. 96-97.
6. Цебржинський О.І. Оксидативна активність у сперматозоїдах // Фізіол. журн. —2000. —Т.46, №4. —C. 71-75.
7. Шугалей И.В., Целинский И.В., Малинина Т.В. О токсическом действии нитрита натрия // Гигиена и санитария. —1991. —№4. —С. 49-53.
8. Jung F., Lassmann G., Ebert B. Detection paramagnetic species in the autocatalytic reaction between hemoglobin and nitrite // Stud. bio-physica. —1981. —V.85, №2. —P. 139-142.
9. Sies H. Oxidative stress. —San Diego CA., 1985. —320 p.
10. Sies H., de Groot H. Role of reactive oxygen species in cell toxicity // Toxicol. Lett. —1992. —№64-65. —P. 547-551.


| Зміст |