|
МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЇ УДК 613.63:001.18:678.7:001.891.573 ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНІЗМУ ВЗАЄМОДІЇ ЕПОКСИДНИХ СПОЛУК З ЛЮДСЬКИМ СИРОВАТКОВИМ АЛЬБУМІНОМО.П. Яворовський, д.м.н., проф., В.І. Зенкіна, А.М. Дацюк, В.В. Лобанов, д.х.н., А.Г. Гребенюк, к.х.н. Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, м. Київ За хімічною будовою речовини можна прогнозувати не тільки її параметри токсичності, а і характер можливої взаємодії з біологічним середовищем, зокрема з протеїнами організму. Це дає великі можливості для дослідження, аналізу та уточнення механізму токсичної дії і, відповідно, пояснення патологічних станів, що розвиваються в організмі під впливом ксенобіотиків. В раніше проведених дослідженнях механізм токсичної дії епоксидних сполук (ЕС) досліджувався на популяційному, організменному, тканинному, клітинному і субклітинному рівнях [1, 2]. Проте на молекулярному і субмолекулярному рівнях він не був з'ясований, що не дозволяло проводити направлений синтез специфічних епоксипротекторів. Цей аспект має велике значення у патогенетичній терапії і патогенетичній профілактиці відповідних професійних уражень. Алергічна реакція є основним проявом впливу епоксисполуки на організм людини. Але, як відомо, сам епоксид за своєю хімічною будовою, проникаючи в кров, не може виступати антигеном. Цей факт породжує гіпотезу і знаходить підтвердження в науковій літературі про те, що ЕС зазнає деяких перетворень в організмі. Так, ЕС взаємодіючи з протеїнами крові, утворює комплекс, який набуває властивостей повного антигену. В той же час, людський сироватковий альбумін (ЛСА) характеризується високою спорідненістю до багатьох ксенобіотиків, іонів металів, метаболітів та до фармакологічних препаратів [3, 4]. Найважливішою фізіологічною властивістю альбуміну є здатність цього білка здійснювати перенесення речовин з потоком крові до різних органів. ЛСА є найпоширенішим серед білків сироватки крові. Його нормальна концентрація в крові становить 5 г/100 мл. Фізіологічні та фармакологічні властивості альбуміну широко вивчаються протягом останніх десятиріч, так як ЛСА відіграє особливу роль в нормальній життєдіяльності організму [4-6]. Основними функціями ЛСА є осмотична і транспортна. Транспортна функція альбуміну визначається специфічними особливостями будови білка. Вчені різних країн проявляють великий інтерес до цього виду білка, їх дослідження спрямовані на вивчення його будови і можливих взаємодій в організмі. Повна уява про стеричну будову ЛСА була відсутня до недавнього часу. І тільки за результатами рентгеноструктурного аналізу останніх років стало можливим більш точне дослідження трьохмірної молекулярної структури ЛСА. Однак, не зважаючи на інтенсивне вивчення, багато питань стосовно структури, функцій, обміну альбуміну залишаються до кінця не з'ясовані. За даними літератури відомо, що ЛСА складається з двох ланцюжків А і В, хірально (зеркально) розміщених один до одного [7, 8]. Кожен з ланцюжків має 585 амінокислотних залишків, молекулярна маса мономерної фракції альбуміну становить 66 000. На рис. 1 зображено схематичну будову ЛСА. Як видно з рисунка, молекула альбуміну складається з трьох доменів: І — амінокислотні залишки 1-195, ІІ — 196-383 і ІІІ — 384-585. Кожен домен розділений на субдомени а і b, які складаються з 6 і 4 петель. ЛСА — спіральний білок з поворотами і розширеними петлями має габарити приблизно 80х80х30 a. Взаємне трьохмірне розміщення доменів і субдоменів молекули альбуміну має серцевидну форму. Розглядаючи епоксисполуку як субстрат можна зробити припущення, що білок ЛСА утворює з субстратом комплекс типу, подібного до фермент-субстратного. Подальші хімічні перетворення ЕС можливі у складі комплексу. В такому комплексі субстрат зв'язується з певною зоною білка, що має назву активного центру. Як правило, активний центр займає відносно невелику ділянку білкової молекули. Крім того, активний центр — це трьохвимірна структура, що має, як свідчать рентгеноструктурні дані, форму щілини або впадини у глобулі білкової молекули. Звичайна практика визначення механізму перетворення субстрату під дією білкової молекули базується на експериментальних даних про просторову будову субстрат-ферментного комплексу. Виходячи з них, можна зробити висновок про зв'язуючу або каталітичну роль тих чи інших амінокислотних залишків протеїну. На сьогодні ще не існує рентгеноструктурних даних про будову комплексу ЛСА із будь-якою ЕС. Тому було вирішено скористатися результатами рентгеноструктурних досліджень структури самого білка. В літературних джерелах вказується на декілька потенційно можливих активних центрів молекули ЛСА, що формуються амінокислотними залишками, які знаходяться, як правило, в значно віддалених одна від одної ділянках поліпептидного ланцюга. Аналіз даних літератури дав можливість вибрати один із таких центрів зв'язування. Його стінки формуються полярними амінокислотними залишками Arg 257, Arg 222, Lys 199, His 242, Arg 218 та Lys 195, які утворюють "внутрішню зв'язуючу порожнину", так звану, "кишеню". Перераховані амінокислотні залишки відносяться до субдоменів Іb і ІІа. Дані про просторову будову цього активного центру були взяті з робіт Sugio S., Kashima A. et al. (1999). Зазначено, що у згаданій "кишені" зв'язуються молекули речовин різної хімічної природи та розмірів у досить великому інтервалі. Це вказує на те, що в межах даного активного центру існують області, які відповідають за зв'язування електронодонорних, електроноакцепторних, протонодонорних та протоноакцепторних ділянок молекул субстратів. Таке можливо лише у тому випадку, коли в цих областях реалізуються неоднорідні електростатичні поля з досить великим градієнтом. З метою аналізу розподілу електростатичного поля або електростатичного потенціалу в межах згаданого можливого центру зв'язування були виконані квантово-хімічні розрахунки фрагменту молекули ЛСА, утвореного залишками Arg 257, Arg 222, Lys 199, His 242, Arg 218 та Lys 195 [9]. Обчислення виконувалися без оптимізації просторової будови виділеного фрагменту за програмою GAMESS у базисі STO-3G. Гідратна оболонка білкової молекули не бралась до уваги. Для компенсації граничних ефектів, пов'язаних з обривом зв'язків виділених амінокислотних залишків з поліпептидним ланцюгом, вільні валентності замикались метильною групою та атомом водню відповідно на N- та С- кінцях (рис. 2). Зрозуміло, що неможливо візуалізувати трьохвимірний розподіл потенціалу (r) у всій щілині, тому побудова його проводилася у двох взаємноперпендикулярних площинах, що зображені на рис. 3. Так, площина АІВІСІdi паралельна площині, яку утворюють атоми азоту полярних груп залишків arg 257, lys 199, his 242 та lys 195 і віддалена від неї на відстань 3 a (характерний радіус дії водневого зв'язку у білкових молекулах). Розподіл r у цій площині наведено на рис. 4. З рисунка видно, що максимум потенціалу спостерігається в околі атома азоту амінокислотного залишка lys 195 і становить 468 кДж/моль. Важливим є те, що область позитивного потенціалу не примикає безпосередньо до ядра атома азоту, а локалізована у порожнині "кишені", що вказує на протоноакцепторні властивості цієї ділянки. Мінімум r (-419 кДж/моль) знаходиться якраз над площиною так званого "гуанідинового ключа" arg 257. Відстань між екстремумами становить 7,8 a. Топологія розподілу r у площинах, паралельних площині АІВІСІdi, аналогічна топології потенціалу, що наведено на рис. 4. З використанням тих самих наближень та методів був розрахований потенціал в площині епоксидного кільця молекули етиленоксиду, що зображено на рис. 5. Як видно з рисунка, розподіл r носить симетричний характер. Мінімум електростатичного потенціалу його зосереджений біля атома кисню і становить - 209 кДж/моль; обидва максимуми (159 кДж/моль) знаходяться на відстані 1,5 a від осі симетрії молекули етиленоксиду. Причому, відстань між негативним та одним з позитивних значень складає 3,8 a. Співставляючи розподіл молекулярного електростатичного потенціалу на рисунках 4 і 5 та повертаючись до поняття фермент-субстратного комплексу, можна виділити декілька основних факторів, що реалізуються при його утворенні: фактор зближення, фіксації та орієнтації. В рамках теорії перехідного стану ці фактори знижують енергетичний бар'єр взаємодії субстрату з активним центром білкової молекули. Умовно в активному центрі можна виділити дві ділянки: зв'язуючу і каталітичну. Молекула оксиду етилену, потрапляючи в центр зв'язування, орієнтується таким чином, що мінімум її потенціалу потрапляє в максимум потенціалу біля залишка Lys 195 і навпаки: один із максимумів молекулярного електростатичного потенціалу оксиду етилену спрямовується до площини "гуанідинового ключа" Аrg 257. Утворюється так званий двоцентровий комплекс за рахунок водневих зв'язків між атомом кисню молекули етиленоксиду і атомом водню полярної групи Lys 195 з одного боку, і між протоноакцепторним центром "гуанідинового ключа" Arg 257 та атомом водню етиленоксиду. Залишок Lys 195 утворює зв'язуючу ділянку у активному центрі. Саме "архітектура" зв'язуючої ділянки забезпечує його комплементарність до структури молекули етиленоксиду, тобто специфічність молекули ЛСА при взаємодії з ЕС. Реакція між етиленоксидом та залишком Lys 195 відбувається за рахунок кооперативної дії сил різної природи. Основну роль відіграють електростатичні взаємодії з помітним внеском водневих зв'язків. Саме електростатичні взаємодії забезпечують зближення молекули оксиду етилену з залишком Lys 195, її орієнтацію та фіксацію. Таким чином, розрахунки електростатичного молекулярного потенціалу дають можливість ідентифікувати ділянки активного центру, що забезпечують зв'язування молекули оксиду етилену молекулою ЛСА, а також зробити деякі обґрунтовані припущення про будову субстрат-ферментного комплексу. Зважаючи на те, що оптимізація просторової будови комплексу не проводилася, неможливо з'ясувати напрямки подальших перетворень етиленоксиду під дією активного центру ЛСА. Отже, квантово-хімічний розрахунок підтвердив гіпотезу про утворення комплексів між ЕС та активними центрами ЛСА. Найімовірніше зв'язування епоксисполуки можливе, як це видно на прикладі етиленоксиду, між амінокислотними залишками "центру зв'язування" — Lys 195 та Arg 257. Проведені квантово-хімічні дослідження підтверджують, що процес взаємодії і утворення комплексу епоксиду з людським сироватковим альбуміном лежить в основі механізму алергічної, токсико-алергічної дії і тих токсичних ефектів, що розвиваються в організмі під впливом епоксидних сполук. Саме цим пояснюються ті зміни, що спостерігаються в шкірі, печінці, нирках і інших органах експериментальних тварин, як і ті захворювання, що зустрічаються у людей під дією ЕС. Література |