УДК: 612.011:615.015.35

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ В ДОКЛИНИЧЕСКОМ ИЗУЧЕНИИ ТОКСИЧНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

В.Н. Коваленко, д.б.н.

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев

В последние время все более ожесточенный характер приобретают дебаты вокруг использования лабораторных животных в научных целях, в том числе при разработке лекарственных средств. Следует заметить, что исследования на животных, проводимые с целью прогнозирования токсического действия лекарственных средств, подвергаются широкой критике не только со стороны противников вивисекции, но и клиницистами, а также самими токсикологами. Она касается как этических норм, так и научной значимости получаемых результатов [1, 2]. Ввиду фундаментальных различий в анатомии, физиологии, патологии и метаболизме человека и животных данные эффективности и токсического действия лекарственных препаратов, получаемые на моделях с использованием животных, часто не находят адекватного подтверждения в клинике [3-7].

С 1920 г. определение средних смертельных доз веществ проводится на животных. Нельзя не согласиться с токсикологами, утверждающими, что такие испытания не только жестоки с этической точки зрения, но довольно часто приводят к ошибочным результаты относительно прогнозирования токсичности вещества для человека. Это обусловлено вариабельностью видов, линий, возраста, пола, массы используемых животных, факторов внешней среды [8-10]. Отрадно заметить, что показатель ЛД₅₀ на международном уровне постепенно утрачивает свое значение.

Поэтому вполне обоснованным является разработка адекватных альтернативных методов исследования [10-15], предусматривающих замену животных на культуры клеток, тканей и пр.

Вместе с тем, относительно внедрения альтернативных методов исследования высказываются различные, порой полярно противоположные мнения. Действительно, использование методов in vitro при разработке и исследовании фармакологических препаратов имеет как преимущества, так и ряд ограничений.

Так, методы in vitro позволяют объяснять биологические явления, которые ввиду комплексности взаимодействия различных эффекторов и ингибиторов сложно исследовать в опытах на животных. Альтернативные подходы способствуют углублению нашего понимания физиологических явлений, а также фармакологического и токсикологического действия веществ путем расшифровки молекулярных и клеточных механизмов. Использование таких методов дает возможность выявлять мишени действия веществ (рецепторы, клеточные компоненты, структурные белки, специфические ферменты, гены, факторы транскрипции и др.), которые впоследствии могут быть использованы в качестве маркеров токсичности. Внедрение методов in vitro обеспечивает фармакологические и токсикологические скрининговые системы для разработки новых субстанций на базе зависимости "структура-активность", позволяет использовать биологические системы, полученные от генетически модифицированных животных, определенные метаболические звенья которых приближены к таковым человека, а также создавать большое количество разнообразных экспериментальных условий одновременно, следовательно, ускорять и увеличивать надежность исследований.

С экономической точки зрения методы in vitro, сокращая сроки получения воспроизводимых и достоверных данных относительно биологической активности большого количества соединений, иногда с использованием автоматизированных систем измерения при различных экспериментальных условиях, способствуют ускорению разработки и внедрения новых препаратов. Выявление токсичности соединений на ранних стадиях испытаний уменьшает финансовые затраты на изучение веществ, которые в дальнейшему не будут внедрены.

К сожалению, использование методов in vitro имеет ряд ограничений. Они обусловлены, чрезмерным упрощением весьма сложных биологических систем, сложностью стандартизации культуральной среды, а также ограниченной продолжительностью жизни и степенью дифференциации клеток первичной культуры, что приводит к потере физиологических свойств и возникновению непредвиденных феноменов. И, наконец, в случае использования наиболее простых систем не учитывается влияние клеточной регуляции.

Высокая стоимость внедрения методов in vitro также является важным препятствием к их широкому внедрению.

С этической точки зрения их недостатком является тот факт, что не смотря на сокращение использования лабораторных животных, они не могут быть полностью исключены ввиду их необходимости для получения тест-систем in vitro (изолированные органы, срезы, клетки и пр.). Исключительное использование методов in vitro для определения токсичности исследуемых соединений вследствие различия получаемых результатов и данных in vivo поднимает проблему их безопасности для человека. Нельзя не отметить также, что соединения, отклоненные на основе результатов, полученных в опытах in vitro, могут быть эффективными при испытаниях in vivo.

Следовательно, несмотря на большое количество исследований по разработке адекватных методов in vitro, они требуют усовершенствования. Особенно это касается прогнозирования потенциальной опасности ксенобиотиков, механизм токсического действия которых сложно предвидеть на основании исследований, ограниченных клеточным уровнем, например, при изучении веществ, осуществляющих свое токсическое действие путем влияния на специфические рецепторы, вследствие кумуляции в организме, образования реактивных метаболитов и пр. Токсичность ксенобиотиков может быть обусловлена как их непосредственным действием, так и посредством интермедиатов, образующихся в тканях вследствие биотрансформации. В последнем случае исследования in vitro с целью прогнозирования токсичности в условиях in vivo требуют поиска путей решения данной проблемы [16].

В связи с этим особое значение приобретают исследования с использованием тест-систем in vitro на основе печени, органа, где, в основном, осуществляется метаболизм и выведение из организма токсических соединений. Такие методы включают использование перфузированной печени, отдельных ее долей, срезов, гомогената и субклеточных фракций, суспензии и культуры гепатоцитов. В последнем случае речь может идти о клеточных линиях гепатомы, перевиваемых гепатоцитах, первичной монослойной культуре, в том числе иммобилизованной на коллагеновом геле или встроенной по типу "сендвича", а также использоваться в двухкомпонентных системах с клетками-хелперами [17].

Основным требованием к таким системам является сохранение способности к метаболизму. Тем не менее, некоторые из приведенных тест-систем имеют ряд недостатков: гомогенаты печени бедны на ферменты I фазы биотрансформации, изучение метаболических процессов и токсичности химических соединений на клетках гепатомы ограничено недостаточным влиянием последних на экспрессию процессов биотрансформации. Следует также учитывать нестабильность ферментов I и II фаз биотрансформаци в свежеизолированных клетках печени и первичной культуре гепатоцитов различных видов животных и человека.

Не смотря на перечисленные недостатки, тест-системы на основе гепатоцитов позволяют исследовать биотрансформацию веществ, в том числе фармакологических субстанций, гепатотоксические свойства, нарушения специфических функций гепатоцитов, опосредствованные метаболизмом эффекты на клетки-мишени [18-20].

Следует подчеркнуть, что при трактовке результатов таких исследований нельзя не учитывать и факторы фармакокинетики, влияющие на взаимодействие между клетками и исследуемыми веществами и способные усложнять интерпретацию данных, полученных в опытах in vitro, а также прогнозировать токсичность веществ in vivo. Существуют различные подходы к оценке роли факторов фармакокинетики относительно екстраполяции критических концентраций веществ, полученных в эксперименте in vitro, на критические дозы in vivo. Надежным способом решения этого вопроса, несомненно, могло бы быть моделирование кинетических процессов [21]. Такой подход достаточно сложен и требует глубоких знаний о состоянии органов-мишеней в условиях in vivo, с одной стороны, и токсикокинетических характеристик веществ, с другой.

Можно использовать несколько биокинетических параметров, тщательно отобранных в условиях in vivo: фракция вещества, абсорбированная из кишечника, кажущийся объем распределения. Это позволяет определить концентрацию вещества в плазме крови в зависимости от введенной дозы и дозу — в зависимости от критической концентрации in vitro [22, 23]. Но для большинства химических веществ, за исключением некоторых фармакологических средств, информация относительно данных параметров в условиях in vivo является ограниченной.

В таком случае фракция, адсорбированная из кишечника, может быть определена на основании данных взаимосвязи между физико-химическими свойствами вещества и его абсорбцией или экспериментальных данных in vitrо. Информация относительно специфических химических веществ и параметры, определяющие состав/компартментализацию частиц в тест-системе in vitrо и в модельных системах in vivo могут использоваться как основа для превращения эффективных концентраций in vitrо в эквивалентные дозы для организма. Для этого необходимо иметь, как минимум, данные относительно физико-химических свойств вещества (рКа, липофильность, пр.), количественной оценки связывания его с белками; основных характеристик системы in vitro, например, концентрация клеток в среде, содержание белка, отношение объемов клеток и культуральной среды, концентрация альбумина в среде. Кроме того, необходимо осуществлять математическое моделирование, позволяющее рассчитывать эквивалентные дозы препарата на единицу массы тела.

Ввиду недостатка необходимых кинетических параметров исследуемых веществ иногда используются прямые сравнения LD₅₀ и ЕС₅₀, как показателей оценки данных, полученных в исследованиях in vitro с целью прогнозирования острой токсичности в условиях in vivo. Для правильной оценки действия критической концентрации препаратов in vitro рекомендуется сравнивать ее с критической концентрацией в месте связывания с клетками-мишенями в условиях in vivo. Ввиду влияния различных факторов на биокинетику концентрация вещества в месте ее связывания не является равной таковой, циркулирующей в крови. Несмотря на это для сравнительной характеристики данных, полученных in vivo и in vitro, допускается использование показателя критической концентрации вещества в плазме. При этом часто применяется линейный регрессионный анализ взаимосвязи между ЕС₅₀ и LD₅₀, правомочный при условии, что исследуемые вещества, во-первых, близки по механизму токсического действия как in vivo, так и in vitro, во-вторых, проявляют аналогичные кинетические свойства in vivo и in vitro. В этом случае линейная корреляция может быть достаточно выраженной [24-29].

Если определять общую цитотоксичность как неблагоприятное воздействие на структуру и свойства клеток, оказывающее влияние на их выживаемость, пролиферацию и функционирование, то на клеточном уровне можно выделить три основные механизма токсического действия веществ: повреждение клеточных мембран, нарушение процессов метаболизма; нарушение регуляции ионного состава и деления клеток.

Применение альтернативных методов изучения острой токсичности требует понимания и точной трактовки понятия типов цитотоксического действия:
— общая цитотоксичность, которая характеризуется одинаковой чувствительностью к действию вещества не зависимо от типа клетки;
— селективная цитотоксичность, отличительной особенностью которой является зависимость чувствительности в отношении токсического агента от типа клетки (например, в результате влияния процессов биотрансформации, связывания со специфическими рецепторами и пр.);
— специфическая функциональная цитотоксичность, имеющая место в случае, если ксенобиотик непосредственно не влияет на клетку, но его действие является критическим на уровне целостного организма (например, в результате влияния на взаимосвязь между клетками, вследствие синтеза, освобождения гормонов и трансмиттеров, угнетения кинетических реакций или специфических процессов транспорта).

Все три типа цитотоксичности могут иметь место in vivo, поэтому должны учитываться в стратегии доклинических исследований in vitro.

В настоящее время предлагается последовательность трех основных этапов скрининговых исследований для прогнозирования острой токсичности в условиях in vitro. На первом этапе определяется общее цитотоксическое действие на основе оценки ингибирования пролиферации клеток. Лучшим объектом для этого является недифференцированная линия клеток, способных к трансформации и быстрому делению. Цель второго этапа исследования — определение гепатотоксичности и роли биотрансформации в токсическом действии исследуемых веществ на клетку. Это может быть осуществлено путем использования одной из вышеуказанных двухкомпонентных систем. На основании сравнения токсичности одного и того же химического вещества в отношении различных типов клеток система исследований на третьем этапе должна обеспечить получение информации, касающейся селективного цитотоксического действия веществ, в том числе на базе данных нарушения возбудимости мембран [30].

С учетом физико-химических свойств исследуемых веществ и токсикокинетических параметров, определенных в опытах in vivo и in vitro, полученные результаты позволяют выявить эффективные дозы, эквивалентные таковым для целостного организма [31]. Если на основании полученных результатов вещество классифицируется как "высокотоксическое", то последующие этапы исследования не осуществляются. При уровне ЕD₅₀, позволяющем отнести его к "практически нетоксическим веществам", для подтверждения полученных данных необходимо провести ограниченные исследования его токсичности в условиях in vivo.

Эксперименты на животных должны доказать, что при оценке токсичности вещества в условиях in vitro параметры его потенциальной токсичности не занижены вследствие влияния механизмов, которые невозможно учесть в условиях in vitro.

Данная схема изучения острой токсичности in vitro, позволяющая выйти на стартовую дозу, способствует уменьшению количества животных для определения класса токсичности вещества.

Культуры клеток человека и животных в качестве биологических систем ввиду их простоты, возможности контроля и большей воспроизводимости по сравнению с тест-системами in vivo все чаще используются токсикологами. Но проблема состоит в определении требований к стандартизации качества культуры клеток и тканей. И хотя уже разработаны и внедрены принципы GLP для альтернативных методов, на 3-м Международном Конгрессе, посвященном альтернативным методам и использованию животных в науке о жизни, выдвинута инициатива создания Good Cell Culture Practice (GCCP), проект которой разработан и в настоящее время рассматривается Европейским центром валидации альтернативных методов [31].

Наряду с методами in vitro в последнее время при оценке потенциальной опасности лекарственных средств предлагается использовать и такие альтернативные методы, как математическое и компьютерное моделирование, система QSAR и др. [32-35].

Литература
1. Barnard N.D., Kaufman S.R. Animal research is wasteful and misleading. —Scientific American. // 1997. —Feb. —P. 80-82.
2. Cohen M.J., Kaufman S.R., Ruttenberg R., Fano A. A critical look at animal experimentation. // Medical Research Modernization Committee. —1998. —P. 1-15.
3. McKenzie R., Fried M.W., Sallie R. et al. Hepatic failure and lactic acidosis due to fialuridine (FIAU), an investigational nucleoside analogue for chronic hepatitis B.// New England Journal of Medicine. —1995. —V. 333. —P. 1099-1105.
4. Lash J.W., Saxen L. Nature. —1971. —August 27. —P. 634-635.
5. Mann R.D. Modern Drug Use, an Enquiry on Historical Principles (MTP Press Ltd., 1984).
6. Roberts P. at al. Drug Metabolism and Disposition. —1991. —V. 19. —P. 841-843.
7. Clink H.M. Br. J. Clin. Pharmacol. —1983. —V. 15. —P. 291S-293S.
8. Шефтель В.О. О преимуществе параметра LD0 по сравнению с LD50. // Гигиена и санитария. —1984. —№11. —С. 66-67.
9. Zbinder G., Flury-Roversi M. Significance of the LD50 tests for the toxicological evaluation of chemical substances. // Arch. Toxicol. —1981. —V. 47. —P. 77-99.
10. Fano A. Lethal laws: animal testing, human health and environmental policy. // London, Zed Books. —1997. —P. 157-159.
11. Comparison of the up-and-down, conventional LD50, and fixed-dose acute toxicity procedures / Lipnick R.L, Cotruvo J.A., Hill R.N. et al. // Food and Chemical Toxicology. —1995. —V. 33. —P. 223 —231.
12. Anon. Statistics of Scientific Procedures on Living Animals in Great Britain 1994. —London: HMSO, 1995. —52 p.
13. Stephens M. Replacing animal experiments, in Langley (ed). Animal experimentation: the consensus changes. New York, Charman and Hall. —1989. —P. 144-168.
14. Clemedson C., McFarlane-Abdulla E., Andersson M. et al. MEIC evaluation of acute systemic toxicity. // Alternatives to laboratory animals. —1996. —V. 24 (suppl.1). —P. 273-311.
15. Shrivastava R. In vitro tests in pharmacotoxicology. // Alternatives to Laboratory Animals. —1997. —V. 25. —P. 339-340.
16. Parish W. The future for acute oral toxicity testing. In: Animals and Alternatives in Toxicology —Present Status and Future Prospects / Ed. M. Balls, J. Bridges, J. Southee. —New York: VCH Publishers, 1991. —P. 19 —20.
17. The practical applicability of hepatocyte cultures in routine testing / Blaauboer B.J., Boobis A.R., Castell J.V. et al. // The report and recommendations of ECVAM workshop 1. —ATLA, 1994. —22. —P. 231 —241.
18. Ericsson A.C., Walum E. Differential effects of allyl alcohol on hepatocytes and fibroblasts demonstrated in roller chamber co-cultures // ATLA, 1988. —15. —P. 208-213.
19. Voss J.-U., Seibert H. Microcarrier-attached rat hepatocytes as a xenobiotic-metabolising system in co-cultures // Cell Biology and Toxicology. —1991. —V. 7. P. 387-399.
20. Voss J.-U., Seibert H. Toxicity of glycols and allyl alcohol evaluated by means of co-cultures of microcarrier-attached rat hepatocytes and Balb/c 3T3 mouse fibroblasts // ATLA, 1992. —20. —P. 266-270.
21. The integrated use of alternative approaches for predicting toxic hazard / Barratt M.D., Castell J.V., Chamberlain M et al. // The report and recommendations of ECVAM workshop 8. —ATLA, 1995. —23. —Р. 410-429.
22. Cytotoxicity evaluation of the first ten MEIC chemicals: acute lethal toxicity in man predicted by cytotoxicity in five cellular assays and by oral LD50 tests in rodents / Ekwall B., Bondesson I., Castell J.V. et al. // АTLА, 1989. —7. —Р. 83-100.
23. Gulden M., Seibert H., Voss J.-U. Inclusion of physicochemical data in quantitative comparisons of in vitro and in vivo toxic potencies // ATLA, 1994. —22. —Р. 185-192.
24. Ekwall B. Correlation between cytotoxicity in vitro and LD50 values // Acta Pharmacologies et Toxicologica. —1983. —V. 52. —P. 80-99.
25. Comparison of the in vitro toxicities of 59 chemicals / Clothier R.H., Hulme L.M, Smith M., Balls M. // Molecular Toxicology. —1987. —V. 1. —P. 571-577.
26. Survey of the QSAR and in vitro approaches for developing non-animal methods to supersede the in vivo LD50 test // Phillips J.C, Gibson W.B. Yam, J. et al. // Food and Chemical Toxicology. —1990. —V. 28. —P. 375–394.
27. Correlation of acute lethal potency with in vitro cytotoxicity / Fry J.R., Garle M.J.; Hammond A.H., Hatfield A. // Toxicology In Vitro. —1990. —V. 4. —P. 175-178.
28. Comparison of in vivo acute lethal potency and in vitro cytotoxicity of 48 chemicals / Shrivastava R., Delomenie C., Chevalier A. et al. // Cell Biology and Toxicology. —1992. —V. 8. —P. 157-170.
29. Garle M.J., Fentem J.H., Fry J.R. In vitro cytotoxicity tests for the prediction of acute toxicity in vivo // Toxicology In Vitro.- 1994.- V. 8.- P. 1303 —1313.
30. Walum E., Varnbo I., Peterson A. A multiple cell-culture toxicity test system based on neuroblastoma C1300 cells and differentiated primary cultures of brain, muscle, heart, and liver cells // Food and Chemical Toxicology. —1986. —V. 24. —Р. 567 —568.
31. Hartung T., Gstraunthaler G., Coecke S. et al. Good cell culture practice (GCCP) —an initiative for standardization and quality control of in vitro studies. The establishment of an ECVAM Task Force on GCCP. // ALTEX. —2001. —V. 18, N 1. —P. 75-78.
32. Головенко М. Лікарська токсикологія // Вісник фармакології та фармації. —2002. —№ 4. —С. 2-8.
33. Johnson D.E., Wolfgang H/I/ Prediction human safety: screening and computational approaches. // Drug Discovery Today. —2000. —V. 5, N 10. —P. 445-454.
34. Barratt M.D., Rodford R.A. The computational prediction of toxicity. // Current Opinion in Chemical Biology. —2001. —V. 5, N 4. —P. 383-388.
35. Terstappen G.C., Reggiani A. In silico research in drug discovery. // Trends in Pharmacol. Sci. —2001. —V. 22, N 1. —P. 23-26.