УДК 577.1:578.083:612.4.42

МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ УЧАСТІ ОКСИДУ АЗОТУ В МЕХАНІЗМІ ДІЇ ХІМІЧНИХ РЕЧОВИН

Л.М. Смердова, С.Г. Шандренко, М.П. Дмитренко, д.б.н.

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, Київ, Україна

Чисельні дослідження по вивченню ролі оксиду азоту (NO) в механізмі дії хімічних речовин [1-3] виконані за допомогою непрямих методів визначення NO-, оскільки ця сполука є високореакційним радикалом з часом життя всього близько 6 с і обмеженим "радіусом" дії. Тому звичайно слідкують за утворенням нітро- та S- і N-нітрозосполук, метгемоглобіну, нітритів, нітратів тощо [4]. Але непрямі методи не дають остаточної відповіді на те, чим в кожному конкретному випадку обумовлена регуляторна або цитотоксична дія: безпосередньо NO-, продуктами його метаболізму чи іншими чинниками.

Відомий метод прямого визначення NO в організмі полягає в тому, що тваринам вводять розчини диетилдитіокарбамату натрію (ДТК) і солі двохвалентного заліза (Fe²⁺). Ці сполуки поєднуються в клітинах і тканинах організму, утворюючи комплекс ДТК-Fe²⁺, здатний міцно зв'язувати NO з формуванням парамагнітного нітрозильного комплексу, сигнал якого реєструється за допомогою методу ЕПР-спектроскопії [5]. В дослідах in vitro для прямого визначення утворення NO клітинами до них в культуральне середовище додають готовий комплекс ДТК-Fe²⁺, через деякий час суспензію клітин заморожують в рідкому азоті і проводять ЕПР-спектроскопію [6]. Недоліком цього методу є те, що комплекс ДТК-Fe²⁺ є нерозчинним, що змушує використовувати його у великій кількості, часто токсичній для клітин. До цього ж він не проникає через плазматичну мембрану і тому може реагувати з NO тільки в позаклітинному середовищі. Крім того, для більшості дослідницьких лабораторій в нашій країні метод ЕПР-спектроскопії недоступний.

Мета роботи — розробити простий чутливий метод визначення ролі NO в механізмі дії хімічних сполук для використання в умовах in vitro.

Матеріали та методи дослідження

В роботі використані реактиви: диетилдитіокарбамат натрію (ДТК-Na), сульфат заліза (ІІ) — FeSO₄•7H₂O, середовище RPMI 1640 фірми "Sigma" (США).

Досліди проводили на білих щурах-самцях масою 150-180 г. Для активації макрофагів тваринам інтраперитоніально вводили вакцину БЦЖ в дозі 1 мг на 100 г маси тіла. На 7-10 добу щурів декапітували під ефірним наркозом. Отримання перитоніальних клітин та виділення макрофагів здійснювали з використанням середовища RPMI 1640, забуференого NaHCO₃ до рН 7,3 [7]. Суспензію виділених макрофагів поділяли на дві частини, одна з яких є контролем, а другу інкубували 30 хв при 37 °С в середовищі RPMI 1640 з 0,1 мкмоль ДТК-Na, центрифугували 3 хв при 1000 об./хв, потім ресуспендували і інкубували 30 хв при 37 °С в середовищі RPMI 1640 з 0,1 мкмоль FeSO₄•7H₂O, та відмивали центрифугуванням і ресуспендували в середовищі RPMI 1640. В результаті такої обробки в мембранах макрофагів формується комплекс ДТК-Fe²⁺, здатний уловлювати і міцно утримувати NO у вигляді мононітрозильного комплексу заліза з ДТК, що проявляє парамагнітні властивості і реєструється методом ЕПР. Виміри сигналів ЕПР проводили на суспензії клітин при температурі рідкого азоту на радіоспектрометрі "Varian E-109". В процесі розробки методу були експериментально підібрані оптимальні концентрації ДТК та Fe, які не приводили до загибелі оброблених клітин протягом 6 год інкубації.

Для порівняльного дослідження ролі NO в цитотоксичності натрію нітропрусиду (НПН), нітрогліцерину (НГ) і нітрозодиметиламіну (НДМА) суспензії контрольних і оброблених макрофагів розливали паралельно в 24-луночні пластикові планшети, додавали по 75 ОД пеніциліну і стрептоміцину, 5 %-ну інактивовану сироватку теляти і досліджувані сполуки в кінцевій концентрації: НДМА — 0,0135 мМ, НПН — 0,1 мМ, НГ — 0,1 мМ. Інкубували в СО₂ — інкубаторі (5 % СО₂) при 37 °С. Через 1, 3, 6 год інкубації визначали життєздатність клітин суправітальним тестуванням за допомогою фарбування трипановим синім. Кількість нітритів в середовищі інкубації клітин визначали за допомогою реактиву Грису [8] модифікованим нами методом [9].

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistika.

Результати та їх обговорення

Принцип нашого методу полягає в тому, що в мембранні структури клітин вбудовується пастка NO — комплекс ДTК-Fe²⁺, здатний уловлювати молекулу NO з утворенням стійкого мононітрозильного комплексу. Для цього клітини, в даному випадку це перитоніальні макрофаги, послідовно інкубують в культуральному середовищі з ДТК, яка є гідрофобною сполукою і тому накопичується в ліпідному шарі мембран клітини, а потім з сірчанокислим залізом. Ця пастка здатна блокувати цитотоксичну дію екзогенного NO.

Суть методу полягає в порівнянні кількості загиблих клітин, інкубованих з тією чи іншою досліджуваною сполукою, при умові використання контрольних та оброблених ДТК і Fe²⁺ клітин. В разі суттєвого зменшення загибелі клітин, в порівнянні з інтактними клітинами при однакових умовах інкубування, можна зробити висновок про участь NO в механізмі дії досліджуваної речовини.

Для того, щоб підтвердити наявність і функціонування в мембранах макрофагів "пастки" NO через суспензії макрофагів як контрольних, так і підданих обробці ДТК та Fe²⁺, пропускали газову суміш 1 % NO в N₂. В результаті, за даними ЕПР-спектрометрії, в спектрі контрольного зразку спостерігався характерний асиметричний синглетний сигнал динітрозильного комплексу ендогенного негемового заліза з SH-вміщуючими білками RSH-Fe-NO (g=2,037). Цей сигнал був повністю відсутнім в спектрі оброблених макрофагів. Замість нього з'явився триплетний сигнал комплексу ДТК-Fe-NO (рис. 1).

Активовані перитоніальні макрофаги посилено синтезують NO, що можна спостерігати за накопиченням в середовищі інкубації клітин іонів NO₂^-. Концентрація нітритів в інкубаційному середовищі макрофагів з комплексом ДТК-Fe зменшена майже в 5 разів на 6-у годину інкубації: в середовищі оброблених клітин вона становила 18,5 нмоль/10⁷кл., а необроблених — 90,5 нмоль/10⁷кл., що вказує на високу акцепторну ємність мембранної пастки по відношенню до NO.

Для визначення загальної кількості мембранної пастки в процесі обробки клітин розчин заліза заміняли на еквімолярний розчин Cu⁺². Утворений комплекс ДТК-Cu²⁺ має парамагнітні властивості, які дозволяють по відповідному сигналу ЕПР розрахувати його концентрацію, а отже і комплексу ДТК-Fe²⁺. Вона становить 18 нмоль комплексу на 10⁷ клітин. В перерахунку на одну клітину в середньому приходиться 10⁹ молекул пастки. Присутність такої кількості пастки в макрофагах суттєво не впливає на їх життєспроможність в процесі інкубації та забезпечує акцепторну ємність щодо NO, достатню для з'ясування участі цієї сполуки в механізмі цитотоксичної дії речовин в умовах in vitro.

Ефективність розробленого методу знаходить підтвердження в дослідах по визначенню цитотоксичної дії донорів оксиду азоту: нітропрусиду натрію, нітрогліцерину і N-нітрозодиметиламіну на активовані перитоніальні макрофаги як контрольні, так і ті, що в своїх мембранних структурах мають пастку NO (рис. 2, таблиця).

Представлені дані вказують на те, що наявність пастки NО в структурі макрофагів майже повністю усувала цитотоксичну дію НПН і НГ, але суттєво не відбивалась на цитотоксичній дії НДMA. Можна припустити, що токсичність НДMA не є результатом метаболічного денітрозування, в процесі якого NO утворюється в значно меншій кількості і, можливо, в інших компартментах клітини, ніж при денітрозуванні НПН і НГ.

Таким чином, результати даного експерименту підтверджують значимість і практичну цінність розробленої нами методики.

Література
1. Porsti I., Paakkari I. Nitric oxide-based possibilities for pharmacotherapy. Ann Med. —1995. —27 (3). —Р. 407-420.
2. Outi Saijonmaa, Ari Ristimaki, Frey Fyhrquist. Atrial natriuretic peptide, nitroglycerine, and nitroprusside reduce basal and stimulated endothelin production from cultured endothelial cells. // Biochem. And Biophys. Research Comm. —1990. —Vol. 173, N2, —P. 514-420.
3. Feelisch M. The use of nitric oxide donors in pharmacological studies. // Naunyn-Schmiedebergs Arch.Pharmacol. —1998. —358. —P. 113-122.
4. Kurt Schmidt, Peter Klatt, Bernd Mayer. Reaction of peroxynitrite with oxyhaemoglobin: interference with photometrical determination of nitric oxide // Biochem.J. —1994. —N301. —P. 645-647.
5. Ванин А.Ф., Манухина Е.Б., Лапшин А.В., Емерсон Ф.З. Усиление синтеза оксида азота при экспериментальном инфаркте миокарда // Бюлл.эксперим.биол. и медицины. —1993. —№8. —C. 142-144.
6. Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф. Влияние прооксидантов на образование оксида азота в печени мышей, обработанных бактериальным липополисахаридом // Биохимия. —1996. —T. 61, вып. 7. —C. 1182-1188.
7. Лимфоциты. Методы / Под ред. Дж.Клауса. —М: Мир, 1990. —401 с.
8. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J.G. Analysis of nitrate, nitrite and 15N-nitrate in biological fluids // Anal.Biochem. —1982. —126. —N1. —P. 131-138.
9. Дмитренко Н.П., Сноз С.В., Смердова Л.Н. и др. Влияние акцепторов оксида азота на критериально значащие биохимические показатели у крыс с нитритной нагрузкой.//Соврем. проблемы токсикологии. —1998. —№1. —C. 24-28.