ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПОВЕРХНОСТНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛЕТОК КРОВИ НА ФОНЕ МОДИФИКАТОРОВ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОГО КАСКАДА. ВОЗМОЖНЫЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

В.В. Жирнов, д.м.н, В.Н. Гавий, Л.Е. Калашникова, к.б.н.

Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины

Как известно, хроническое облучение организма малыми дозами ионизирующей радиации (ИР) приводит к развитию различной патологии, обычно связанной с нарушением нейрогуморальной регуляции. Однако механизмы, лежащие в основе этих патологических нарушений, остаются мало изученными.

Недавно нами было показано, что b-излучение в дозах 0,02-0,2 мГр и аналогичной мощности стимулирует хемокинез нейтрофилов, а облучение лимфоцитов дозой 0,024 мГр и выше дозозависимо угнетает розеткообразование. Действие таких доз (мощностей доз) ионизирующей радиации опосредствовалось мембранными сигнальными системами клетки [1]. Причем, эти эффекты не сопровождались изменением состояния прооксидантно-антиоксидантной системы клеток. Кроме того, оказалось, что изменения клеточной активности, вызванные этими дозами ИР, сопровождаются изменениями компоненты поверхностного мембранного потенциала (ПП), которая контролируется сигнальными каскадами [2]. Эти данные позволяют предположить, что патология, вызываемая воздействием радиации в данном диапазоне малых доз, может быть результатом напряжения сигнальных систем вследствие хронического воздействия излучения на их звенья (сигнальный или биоинформационный стресс). Прямое подтверждение этого было получено в опытах, осуществленных в условиях наложения внешнего радиационного поля и после его снятия [1]. Оказалось, что ответ клеток при эквивалентных мощностях дозы ИР происходил только под облучением. Кроме того, было показано, что клеточные ответы на ИР в этом диапазоне поглощенных доз могут модифицироваться модуляторами аденилатциклазной (АЦ) сигнальной системы и наоборот [4]. Так, облучение клеток крови в дозе 5 мкГр нивелировало действие низких концентраций пропранолола (антагониста b-адренорецепторов) на ПП, а более высокие концентрации пропранолола отменяли эффект ИР на этот показатель, тогда как ответ ПП клеток крови к агонистам b-адренорецепторов (адреналину и изопретеренолу) на фоне облучения не изменялся [2, 3]. Эти результаты фундаментальных исследований имеют и важное практическое значение, т.к., с одной стороны, могут послужить основанием для фармакопрофилактики и фармакотерапии радиозависимой патологии, а с другой, — оценить влияние повышения радиационного фона на специфическую эффективность фармпрепаратов.

Целью данной работы является дальнейшее изучение возможной роли компонентов АЦ системы в механизмах действия малых доз ИР на ПП клетки. В работе изучено влияние блокатора a₂-адренорецепторов — йохимбина, проникающего через клеточную мембрану аналога мессенджера АЦ каскада — дибутирил-цАМФ, и антагониста А₁-аденозиновых рецепторов — теофиллина на ответ ПП нейтрофилов и эритроцитов крови человека на фоне малых доз ионизирующего излучения.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили на эритроцитах и полиморфноядерных лейкоцитах (ПМЯЛ) человеческой крови. Эритроциты и ПМЯЛ выделяли из цельной крови доноров путем центрифугированием в рабочем электрофоретическом растворе [5, 6].

Для оценки величины заряда на плазматической мембране клеток определялась их электрофоретическая подвижность (ЭФП, мкм•см/В•с) методом микроэлектрофореза, которая связана с поверхностным потенциалом на мембране известным соотношением [7]. Электрофорез клеток крови проводили при комнатной температуре согласно [7, 8] после внесения в среду инкубации радиоактивного изотопа 90Sr в концентрациях 1,2•10^-6 Ки/л. Время инкубации клеточной суспензии с радионуклидом составляло 1 час. Поглощенные клетками дозы излучения рассчитывались согласно [9]. Йохимбин, дибутирил-цАМФ и теофиллин (в концентрациях, не действующих на цАМФ-фосфодиэстеразу) вносили в среду инкубации в соответствующих концентрациях за 10 мин до внесения радионуклида. Результаты экспериментов представлены в виде средних значений ЭФП и их среднеквадратичных отклонений. Объем выборок (n) везде был равен 6. Достоверность полученных результатов оценивалась по Стъюденту.

Результаты и обсуждение

Данные о влиянии йохимбина, который повышает уровень цАМФ в клетках путем ингибирования a₂-адренорецепторов, и его совместное действие с ИР (5 мкГр) на ЭФП лейкоцитов представлены на рис. 1 и 2.

Приведенные данные свидетельствуют, что йохимбин в концентрациях 1•10^-7-1•10^-4 М практически дозонезависимо угнетает ЭФП ПМЯЛ в среднем, примерно, на 32 % (р<0,05). Аналогичный по величине ответ ЭФП (угнетение на 36 %) наблюдается и при облучении. Однако при концентрации йохимбина 1&3149;10^-8 М регистрируется обратный эффект, т.е. ускорение ЭФП относительно контроля (р<0,05). При исследовании совместного действия йохимбина и ИР установлено, что действие препарата на ЭФП достоверно не меняется под влиянием ИР во всем диапазоне концентраций йохимбина, т.е. не отмечается ни аддитивного ответа, ни даже его потенцирования, несмотря на однонаправленное действиe обоих факторов на этот показатель. Напротив, можно отметить выраженную тенденцию к увеличению ЭФП при минимальной и максимальной концентрациях йохимбина на фоне облучения (0,05<р<0,1).

Данные, приведенные на рис. 2, показывают, что в диапазоне концентраций йохимбина 1•10^-5—1•10^-7 М, как и в случае с ПМЯЛ, наблюдается дозонезависимое, но несколько более выраженное снижение (в среднем на 38 %) ЭФП эритроцитов. В то же время в максимальной концентрации препарат был менее эффективен, чем при более низких концентрациях, и замедлял ЭФП эритроцитов только на 26 %, а в минимальной, в отличие от ПМЯЛ, не вызывал инверсии ответа. Сама ИР вызывала снижение ЭФП эритроцитов на 22 %, т.е. эффективность действия облучения на эритроциты была в 1,7 раза ниже, чем йохимбина. На фоне облучения при концентрациях йохимбина 1•10^-5—1•10^-6 М отмечается тенденция к снижению угнетающего действия йохимбина на ЭФП эритроцитов, которая при концентрации препарата 1•10^-7 М проявляется в достоверном снятии эффекта лиганда. При минимальной концентрации йохимбин не влиял на ЭФП эритроцитов, но снимал ингибирующее действие ИР.

Таким образом, ионизирующее излучение in vitro модифицирует действие антагониста a₂-адренорецепторов на поверхностный потенциал эритроцитов, но не лейкоцитов крови человека. Инверсия ответа ЭФП лейкоцитов при минимальной концентрации йохимбина может указывать либо на присутствие в этих клетках a₂-адренорецепторов, связанных через G_i-белки с компонентами фосфоинозитидного каскада или ионными каналами, либо на наличие высокоаффинного минорного пула этих рецепторов, связанных с G_s-белками. Во всяком случае, известно, что, по крайней мере, во многих клетках млекопитающих различные подтипы a₂-АР связаны через G_i/о-белки не только с аденилатциклазой [10], но и фосфолипазой С [11], гуанилатциклазой [12] ионными каналами [13]. Это позволяет предположить, что наблюдаемые концентрационные различия в эффектах йохимбина на фоне ИР обусловлены включением в ответ различных сигнальных путей. Более того, на такие возможности косвенно указывает факт устранения радиацией действия йохимбина в этой концентрации.

Данные о влиянии дибутирил-цАМФ, непосредственного аналога мессенджера аденилатциклазного каскада, на ЭФП клеток крови представлены на рис. 3 и 4.

Как показано на рис. 3, дибутирил-цАМФ в концентрациях 10^-4-10^-6 М снижает ЭФП лейкоцитов в среднем на 25 %. При исследовании совместного действия дибутирил-цАМФ и ИР на лейкоциты установлено, что облучение клеток не изменяет ответ ЭФП на препарат в этом диапазоне концентраций. В меньших концентрациях дибутирил-цАМФ не вызывает достоверных изменений величины ЭФП клеток крови и проявляется только эффект ИР.

Как видно на рис. 4, дибутирил-цАМФ в концентрациях 10^-4-10^-6 М снижает ЭФП эритроцитов в среднем на 30 %. Однако, в отличие от ПМЯЛ, облучение при концентрации препарата 10^-4 М достоверно потенцирует ответ ЭФП эритроцитов к препарату, примерно, на 10 %, не оказывая влияние на эффект других концентраций препарата в этом диапазоне. При более низких концентрациях дибутирил-цАМФ проявляется действие только ИР.

Данные о влиянии теофиллина на ЭФП клеток крови приведены на рис. 5 и 6. Представленные данные показывают, что теофиллин в концентрациях 10^-6-10^-4 М дозонезависимо снижает ЭФП обоих типов клеток крови в среднем на 20 %. В более низких концентрациях теофиллин не влияет на величину ЭФП клеток. В то же время, в недействующем диапазоне концентраций препарата проявляется эффект ИР.

Также показано, что ИР не изменяет действие данного агента на ЭФП нейтрофилов, т.е. проявляется эффект самого теофиллина. Однако препарат в диапазоне эффективных концентраций снижает влияние ИР на ЭФП эритроцитов.

Как известно, теофиллин в использованных концентрациях является эффективным ингибитором аденозиновых рецепторов А₁, повышая тем самым уровень цАМФ в ПМЯЛ [14]. Частичное уменьшение действия ИР на ЭФП лейкоцитов, наблюдаемое на фоне теофиллина, по-видимому, обусловлено тем, что эти рецепторы могут связываться с различными подтипами семейства G_i-белков, которые не только ингибируют аденилатциклазу, но и активируют некоторые типы ионных каналов Ca²⁺ и K⁺, а также фосфолипазы С, А₂ и D [15]. Однако аналогичный ответ эритроцитов вряд ли можно этим объяснить, т.к. сам теофиллин вызывает аналогичное по величине снижение ЭФП.

Таким образом, принимая во внимание все изложенные результаты, можно заключить, что стимуляция аденилатциклазной системы приводит к снижению отрицательного заряда на мембране клеток крови. По-видимому, этот же механизм лежит и в основе действия ИР. Действительно, наличие одинакового по величине и направленности действия ИР и дибутирил-цАМФ, вызывающего в эффективных концентрациях максимальный ответ клеток, и отсутствие взаимного влияния этих факторов на ЭФП является достаточно убедительным подтверждением этого. Как уже указывалось, снижение в ряде случаев эффективности антагонистов рецепторов на фоне ИР и изменение направленности действия йохимбина, вероятно, указывает на включение в их механизмы действия других сигнальных систем. Все же, основной результат работы заключается в том, что показанное модифицирующее действие ИР на модуляторы сигнальных путей клеток может лежать в основе ее патологического действия на организм. Действительно, независимо от того, какие сигнальные системы включены в ответ на малые дозы ИР, в итоге, при длительном воздействии, соответствующая сигнальная система(ы) будет адаптироваться к действующему фактору с выходом на новый уровень функционирования (например, снижение чувствительности возбужденной сигнальной системы в результате гетерологической интернализации ее рецепторов и т.п.), что, учитывая возможность включения в ответ на ИР большинства клеточных пулов организма, может привести к общему нарушению нейрогуморальной регуляции.

Литература
1. Effect of small doses of ionizing radiation on mobility, rosette formation, and antioxidant state of leukocytes under modification of G-protein by cholera and pertussis toxins / Zhirnov V.V, Luik A.I., Metelitsa L. A. // Доповіді НАН України. —2000. —№10 —С. 172-176.
2. Жирнов В.В., Калашнікова Л.Є., Гавій В.М. // Міжнародна науково- практична конференція "Сучасні екологічні проблеми Украінського Полісся і суміжних територій". Тез. Докл. Ніжин, 18-20 вересня 2001. —С. 67.
3. Жирнов В. В., Калашнікова Л.Є., Гавій В.М. // Тез. Докл. Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті академіка В.В.Фролькіса, м. Київ, 28 січня 2002. —С. 64—65.
4. Zhirnov V., Luik A., Metelitsa L., Mogilevich S. Modification of cellular functionl responses to cardioactive drugs by small doses of ionizing radiation //Abstr. Book the second multidisciplinary conference on drug research, MKNOL 2000, Jelena Gora-Cieplice, 5-7 April 2000. —P. K19.
5. Хейфец Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности фиколл- верографин. // Лаб. дело. —1973. —№10. —C. 579-582.
6. English D., Anderson B.R. Single —step separation of red blood cells, granulocytes on discontinuous density gradients of ficoll-hypaque. // J. Inmunoe. Methods. —1974. —V. 5. —P. 249-252.
7. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А., Электрофорез клеток крови в норме и патологии. Минск: Беларусь, 1974. —143 с.
8. Долгая Е.В., Миронов С.Л., Погорелая Н.Х. Исследования поверхностного заряда нейронов спинальных ганглиев крыс при помощи метода микроэлектрофореза // Нейрофизиология. —1984. —Т. 16, №2. —C. 176-182.
9. Loevinger R. Distribution of adsorption energy around a point source of b-radiation // Science. -1956. —V. 112, №2. —P. 530.
10. Panosian J.O., Mrinetti G.V. Alpha 2-adrenergic receptors in human polymorphonuclear leukocyte membranes // Biochem Pharmacol. —1983. —V. 32, N14. —P. 2243-2247.
11. Alpha 2A-adrenergic receptor stimulated calcium release is transduced by G_i-associated G(beta gamma)-mediated activation of phospholipase C / Dorn G.W., Oswald K.J., McCluskey T.S, Kuhel D.G., Liggett S.B. // Biochemistry. —1997. —V. 36, N2. —P. 6415-6423.
12. Evidence for alpha-adrenergic receptors acting through the guanylate cyclase system in human cultured thyroid cells. / Brandi M.L., Rotella C.M., Tanini A., Toccafondi R.S. // Acta Endocrinol. (Copenh). —1983. —V. 104, N1. —P. 64-68.
13. Multiple second messenger pathways of a2-adrenergic receptor subtypes expressed in eukaryotic cells / Cotecchia S., Kobilka B.K., Daniel K.W., Nolan R.D., Lapetina E.Y., Caron M.G., Lefkowitz R.J., Regan J.W. // J. Biol. Chem. —1990. —V. 265, N1. —P. 63-69.
14. Adenosine receptors on human leukocytes. IV. characterization of an A-1/R-1 receptor / Marone G., Petracca, R., Vigorita, S., Genovese, A. // International Journal of Clinical and Laboratory Research. —1992. —V. 22, N4. —P. 235-246.
15. International Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and Classification of Adenosine Receptors /Bertil B. Fredholm, Adrian P. IJzerman, Kenneth A. Jacobson, Karl-Norbert Klotz and Joel Linden // Pharmacologicl Review. —2001. —V. 53, N4. —P. 527-552.