|
МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЇ УДК 577. 17:612.015.11:577.152.261 ВЛИЯНИЕ ЭМБИХИНА НА СОСТОЯНИЕ ГЛУТАТИОН-ДЕГРАДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ У КРЫСЛ.В. Бойцова, к.б.н. Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, г. Киев Восстановленный глутатион принимает участие во многочисленных жизненно важных клеточных функциях [1-3]. В восстановленной форме глутатион обладает выраженными нуклеофильными свойствами и может взаимодействовать с электрофильными соединениями через прямую Sn2 реакцию с образованием тиоэфиров. Противоопухолевые препараты, синтезированные на основе дихлордиэтиламина и содержащие алифатический заместитель при атоме азота, обладают высокой алкилирующей активностью по отношению к нуклеофильным центрам разных молекул [4]. Метаболизм эмбихина в организме экспериментальных животных связан с активацией ферментов II фазы биотрансформации ксенобиотиков, в частности, с увеличением активности глутатион-S-трансфераз [5]. Деградация глутатионовых конъюгатов, инициируемая g-глутамилтранспептидазой, и дальнейший гидролиз производных цистеинилглицина до составляющих его аминокислот происходит на внешней поверхности мембран микроворсинок почек, тощей кишки, придатков яичка [6]. b-лиазы превращают S-замещенные цистеиновые конъюгаты в пируват, аммиак и тиолы [7]. Преобладающее количество веществ, которые связываются с восстановленным глутатионом, образуя соответствующие тиоэфиры, в конечном итоге выделяются с мочой в виде меркаптуровых кислот. Конъюгация с глутатионом в большинстве случаев рассматривается как реакция детоксикации [8]. Процессы деградации глутатионовых конъюгатов при воздействии эмбихина практически не исследованы. С целью выяснения состояния глутатион-деградирующих ферментов в механизме цитотоксического действия эмбихина изучали содержание восстановленного глутатиона, активность g-глутамилтранспептидазы, пептидазы, аминопептидазы М, b-лиазы в печени и почках крыс под воздействием эмбихина в дозе 1/2 ЛД50. Материалы и методы исследования Опыты проведены на 60 белых крысах-самках с массой тела 200-240 г, которые содержались на стандартном рационе вивария. Животным однократно вводили эмбихин в дозе 1/2 ЛД50 (0,825 мг/кг подкожно). В каждом варианте эксперимента использовали по 6 животных. Рабочий раствор препарата готовили на физиологическом растворе из кристаллического метил-ди(2-хлорэтил)амина гидрохлорида, синтезированного в ИФТ АМН Украины. Через 15, 30 мин, 1,3, 6 ч, 1, 3 сут животных декапитировали под эфирным наркозом. Забор печени и почек для дальнейших биохимических исследований проводили на холоду. Печень отмывали от эритроцитов холодным физиологическим раствором, почки декапсулировали. Определение содержания восстановленного глутатиона проводили в депротеинизированном цитозоле флюориметрическим методом [9] с регистрацией показателей на флуориметре Hitachi MPS-4 (Япония). В качестве флюоресцентного реагента использовали о-фталевый альдегид ("Sigma", США). Супернатант из гомогената печени получали методом дифференциального центрифугирования при 100000 g на протяжении 1 ч на центрифуге МSF-65 (Англия) [10] с угловым ротором. Мембраны щеточной каймы почек выделяли по методу [11]. Активность b-лиазы в супернатанте оценивали по степени окисления NADH ("Sigma", США) [12] в сопряженной реакции с лактатдегидрогеназой ("Sigma", США) при 340 нм. Активность мембраносвязанных ферментов почек определяли: g-глутамилтранспептидазы (g-ГТП) — по убыли g-a-глутамилпаранитроанилида ("Sigma", США) [13], дипептидазы — при помощи нингидрин-цианидного метода [14] по степени гидролиза L-Ala-Gly ("Sigma", США); аминопептидазы М [6] — по уменьшению L-Leu-p-нитроанилида ("Sigma", США) при 410 нм. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Shimadzu MPS-500 (Япония). Содержание белка в гомогенате, супернатанте и суспензии мембран микроворсинок определяли по методу Лоури [15]. Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты анализа показателей считали достоверными при p<0,05. Результаты и их обсуждение Результаты изучения влияния эмбихина в дозе 1/2 ЛД50 на содержание восстановленного глутатиона и активность глутатион-деградирующих ферментов представлены на рисунке и в таблице. В ранние сроки после введения эмбихина в печени и почках отмечено снижение содержания восстановленного глутатиона, которое вызвано как прямым действием цитостатика на SH-группы, так и ферментативным связыванием трипептида с образованием соответствующих конъюгатов. В ответ на уменьшение в клетке концентрации восстановленного глутатиона в печени через 3 ч, а в ткани почек спустя 1 сут регистрировалось компенсаторное повышение содержания трипептида, свойственное веществам алкилирующего типа действия [16]. В более отдаленный период интоксикации отмечено дальнейшее уменьшение концентрации восстановленного глутатиона: в печени через 6 ч — на 21,2 %, а в почках спустя 72 ч — на 20,0 % по сравнению с интактными животными. Как было нами показано ранее[17], тиопривный эффект эмбихина в клетке реализуется через связывание алкилирующего агента с небелковыми сульфгидрильными группами (восстановленный глутатион, свободные тиолы), тогда как SH-группы белков задействованы в этом процессе незначительно. Биотрансформация эмбихина протекает с вовлечением ферментов II фазы детоксикации, а именно глутатионтрансфераз [5]. Накопление в клетке конъюгатов восстановленного глутатиона и свободных тиолов приводило к снижению дипептидазной и аминопептидазной активности в тканях почек через 1 ч после введения алкилирующего агента на 48,2 % и 33,0 %, соответственно, по отношению к интактным крысам. На фоне снижения уровня восстановленного глутатиона, которое связано главным образом с метаболической детоксикацией цитостатика, через 3 ч, 6 ч отмечено повышение активности глутатион-деградирующих ферментов — g-ГТП и пептидазы. Активность g-ГТП после введения цитостатика повышалась на 30,1 %, 32,7 %, соответственно, стимулируя начало деградации восстановленного глутатиона и его конъюгатов с отщеплением g-глутамильного остатка. Увеличение содержания соответствующих дипептидов в тканях почек, возможно, является одной из причин повышения дальнейших процессов катаболизма глутатионовых конъюгатов. Активность дипептидазы в мембранах микроворсинок щеточной каймы почек увеличивалась на 31,8 % и 52,8 % , соответственно, по отношению к интактным животным параллельно с активностью g-ГТП. В тоже время не было отмечено изменения активности аминопептидазы М. Цистеинконъюгат b-лиаза катализирует метаболизм S-замещенных цистеиновых конъюгатов и является начальным ферментом на пути синтеза меркаптуровых кислот [18]. Эмбихин через 30 мин после введения вызывал снижение активности b-лиазы в печени крыс на 29,3 % по отношению к интактным животным (рисунок), что приводит к нарушению метаболизма восстановленного глутатиона и является, наряду с процессами конъюгации и повышения активности глутатион-зависимых ферментов, одной из возможных причин снижения содержания трипептида в клетках печени через 1 ч после введения противоопухолевого препарата. Активация процессов катаболизма глутатионовых конъюгатов после введения цитостатика сопровождается повышением b-лиазной активности через 3 ч и 6 ч на 46,1 %, 29,9 %, соответственно (рисунок). Таким образом, проведенные исследования показали, что цитотоксический эффект эмбихина проявляется в уменьшении концентрации восстановленного глутатиона и снижении активности дипептидазы, аминопептидазы М и b-лиазы в печени и почках на раннем этапе интоксикации. Снижение в клетке содержания восстановленного глутатиона приводит к появлению компенсаторного увеличения концентрации трипептида. Повышение активности глутатион-деградирующих ферментов, которое наблюдалось через 3 ч, 6 ч после введения цитостатика, обеспечивает метаболическую детоксикацию эмбихина, тем самым снижая цитотоксические эффекты противоопухолевого препарата. Литература |