МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЇ УДК 615.9-02:547.539.3:577.158.83 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ГЕПАТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БРОМБЕНЗОЛА И МАРКЕРНЫХ АКТИВНОСТЕЙ ЦИТОХРОМА Р450 И ФЕРМЕНТОВ КОНЪЮГАЦИИС.А. Качула, А.А. Пентюк, д.м.н., Е.В. Тертышная, к.б.н., О.Г. Вовк, к.б.н. Государственный медицинский университет, г. Винница Токсичность бромбензола в значительной мере определяется путями биотрансформации, поскольку в процессе его окисления появляются електрофильные метаболиты (эпоксиды), оказывающие повреждающее действие на клетки [17]. Кроме того существуют и пути метаболизма, ведущие к образованию неактивных конъюгированных метаболитов с глюкуроновой, серной кислотами и глутатионом [12, 15, 18]. Имеются значительные индивидуальные различия в чувствительности животных к токсическому действию бромбензола [16]. Однако, относительный вклад отдельных изоформ цитохрома Р450 (CYP) и ферментов конъюгации в токсификацию и детоксикацию бромбензола и его метаболитов до настоящего времени не оценен, что сдерживает поиск эффективных способов предупреждения и лечения токсических повреждений печени этим ядом. Целью работы явилось выяснение вопроса, в какой мере гепатотоксический эффект бромбензола детерминируется активностью изоформ цитохрома Р-450 и других ферментов, участвующих в его метаболизме. Для этого в опытах in vivo и in vitro сопоставлялась способность печени крыс к биотрансформации некоторых изоэнзимспецифических субстратов с выраженностью гепатотоксического действия бромбензола. Материалы и методы исследования В опытах использовано 237 белых крыс-самцов массой 170-240 г. Способность крыс к метаболизму ксенобиотиков оценивали с помощью тест-препаратов — амидопирина и ацетанилида. Метаболизм амидопирина оценивали по экскреции в течение 12 ч с мочой свободного и ацетилированного 4-аминоантипирина (4-ААП) после его внутрибрюшинного введения в дозе 12,8 мкмоль/100 г массы животного [7]. Метаболизм ацетанилида оценивали по мочевой экскреции за 12 ч его анилидных и аминофенольных метаболитов после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 74 мкмоль/100 г массы [5]. В микросомах печени определяли ацетанилид- и анилингидроксилазную активности по образованию пара-аминофенола; амидопирин-N-, метопролол-0- и эритромицин-N-деметилазные активности — по образованию формальдегида [2]; пара-нитрофенолгидроксилазную активность — по образованию пара-нитрокатехола [14]; ариламидазную активность карбоксилэстеразы [КФ 3.1.1.1] — по гидролизу ацетанилида [11]; активность УДФ-глюкуронилтрансферазы [КФ 2.4.1.17] — по конъюгации пара-нитрофенола [9]. В постмитохондриальной фракции печени оценивали активность фенолсульфотрансферазы [КФ 2.8.2.1] — по образованию сульфоэфира бета-нафтола, используя систему, генерирующую фосфоаденозинфосфосульфат [13]; глутатион-S-трансферазы [КФ 2.5.1.18] — по образованию конъюгатов с 1-хлор-2,4-динитробензолом [10]. В постядерном гомогенате определяли активность N-ацетилтрансферазы [КФ 2.3.1.5] — по конъюгации с пара-аминобензойной кислотой [21]. Гепатоциты получали коллагеназным методом [4], а их жизнеспособность оценивали по окрашиванию трипановым синим, снижению уровня глутатиона (G-SH) и выходу лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [КФ 1.1.1.27] во внеклеточную жидкость при инкубации гепатоцитов в присутствии 0,6 mМ бромбензола в течение 120 мин. Функциональное состояние печени исследовали через 24 ч после перорального введения крысам 1 г/кг бромбензола, исследуя в сыворотке крови активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) [КФ 2.6.1.2] [3], в гомогенате печени — содержание восстановленного глутатиона [8], в микросомной фракции печени активность глюкозо-6-фосфатазы [КФ 3.1.3.9] и уровень малонового диальдегида [1, 6]. Результаты и их обсуждение В опытах на изолированных гепатоцитах сопоставляли токсический эффект бромбензола с активностью ферментов. Для этого анализ результатов проводили в трех группах гепатоцитов — соответственно с высокой, средней и низкой активностью ферментов, метаболизирующих ксенобиотики (табл. 1). Оказалось, что индуцируемое бромбензолом снижение жизнеспособности гепатоцитов (оценивали по поглощению трипанового синего, выходу ЛДГ и снижению содержания восстановленного глутатиона) в наибольшей степени соответствует маркерным активностям cyp2Е1 (пара-нитрофенолгидроксилаза, анилингидроксилаза), что соответствует данным литературы об участии этого фермента в метаболизме бромбензола [20]. Обнаружена также некоторая зависимость токсичности бромбензола от активности амидопирин-n-деметилазы (cyp2В и 2С). Практически отсутствует связь с маркерными активностями цитохромов cyp1А2, ЗА и 2d. Изучение корреляционных связей между активностью метаболизирующих ферментов и токсичностью бромбензола подтвердило приведенные выше выводы (табл. 2). Из ферментов конъюгации значительную связь с токсичностью бромбензола проявляют глутатион-S-трансфераза, высокая активность которой совпадает со слабым действием бромбензола на гепатоциты. Это можно объяснить способностью фермента инактивировать токсические метаболиты бромбензола за счет образования аддуктов эпоксидных метаболитов с глутатионом [19]. Другие ферменты (УДФ-глюкуронилтрансфераза, фенолсульфотрансфераза), которые образуют конъюгаты с фенольными и дигидродиольными метаболитами бромбензола (и тем самым усиливают его элиминацию), также способствуют снижению уровня токсического воздействия бромбензола. Активность N-ацетилтрансферазы и карбоксилэстеразы слабо коррелируют с токсичностью бромбензола. Эти данные показывают, что в условиях in vitro наиболее полно токсический эффект бромбензола проявляется по отношению к гепатоцитам с высокой активностью CYP2Е1, 2В и 2С и, напротив, его токсичность ниже при высокой активности конъюгирующих ферментов. Однако, существует ли подобная зависимость в целостном организме? Для ответа на этот вопрос мы за 1-2 дня до введения бромбензола оценивали активность ферментов метаболизма ксенобиотиков по экскреции с мочой метаболитов амидопирина и ацетанилида. N-деметилирование амидопирина, как известно, катализируется CYP2В и 2С, а образующийся 4-ААП коньюгируется при участии N-ацетилтрансферазы. Известно, что окисление ацетанилида в пара-ацетиламинофенол осуществляется ферментом CYP1А2, а связывание аминофенольных метаболитов — изоформами УДФ-глюкуронилтрансферазы и фенолсульфотрансферазы. Гидролиз ацетанилида осуществляется одной из изоформ карбоксилэстеразы. В процессе метаболизма ацетанилида при участии CYP2Е1 образуется токсический метаболит N-ацетилбензохинонимин, который после соответствующих превращений экскретируется с мочой в виде меркаптуровых кислот. По результатам предварительногого тестирования животные также были разделены на группы с высокой, средней и низкой скоростью соответствующих реакций биотрансформации тест-препаратов (табл. 3). Была оценена также сила корреляционной связи между экскрецией метаболитов амидопирина и ацетанилида и гепатотоксичностью бромбензола (табл. 4). Оказалось, что токсичность бромбензола (оцениваемая по изменению активности сывороточной АлАТ и микросомальной глюкозо-6-фосфатазы, падению уровня восстановленного глутатиона в печени и увеличению содержания малонового диальдегида) наиболее тесно связана со способностью крыс превращать ацетанилид в меркаптуровые кислоты, то есть с активностью CYP2Е1. Данные литературы свидетельствуют, что и бромбензол в организме животных превращается в соответствующие меркаптуровые кислоты [22]. Значительно в меньшей мере токсичность бромбензола оказалась связанной с образованием 4-ААП и пара-аминофенола (эти метаболиты отражают активность CYP2В/2С и CYP1А2, соответственно). Обнаруживалась обратная связь между активностью реакций конъюгации пара-аминофенола с глюкуроновой и серной кислотами и токсичностью бромбензола. Токсическое действие бромбензола оказалось меньшим у животных с высокой способностью к глюкуронидации и сульфатации. В целом данные на животных подтверждают закономерности, обнаруженные в опытах на изолированных гепатоцитах. Таким образом, использование тест-препаратов позволяет оценить активность отдельных ферментов в целостном организме и выявить особи, более чувствительные к действию бромбензола, а, возможно, и других ксенобиотиков, имеющих сходные с бромбензолом пути биотрансформации. Полученные данные частично объясняют разную индивидуальную чувствительность животных к бромбензолу, поскольку показывают, что высокий индивидуальный уровень экспрессии цитохрома CYP2Е1, в меньшей мере CYP2В и 2С, определяют более высокую чувствительность крыс к гепатотоксическому действию бромбензола. С другой стороны, высокая активность процессов конъюгации с глюкуроновой и серной кислотами является предиктором большей устойчивости животных к бромбензолу. Очевидно, разработка подходов к прогнозированию, профилактике и лечению токсических поражений печени бромбензолом и другими ксенобиотиками, имеющими сходные пути метаболизма, должна включать тестирование активности цитохрома Р-450 и других метаболизирующих ферментов и целенаправленное воздействие на эти ферменты, например, с помощью селективных ингибиторов и индукторов. Выводы 1. Инкубация бромбензола с гепатоцитами крыс вызывает снижение запасов восстановленного глутатиона, выход из клеток лактатдегидрогеназы и их прокрашивание трипановым синим. Высокая активность в печени крыс СYP2Е1 усиливает повреждающее действие бромбензола, а высокая активность глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы и фенолсульфотрансферазы, напротив, уменьшает его. Токсичность бромбензола слабо коррелирует с активностью CYP1A2, 2B и 2C, карбоксилэстеразы и N-ацетилтрансферазы. 2. Крысы с высокой способностью к превращению ацетанилида в меркаптуровые кислоты отличаются более высокой чувствительностью к токсическому действию бромбензола, тогда как животные с повышенной способностью метаболизировать ацетанилид с образованием глюкуронидных и сульфатных метаболитов отличаются большей устойчивостю к бромбензолу. 3. Предварительное тестирование животных с помощью ацетанилида и амидопирина позволяет выявить особи с различной чувствительностью к бромбезолу, и этот подход может быть использован для прогнозирования индивидуальной чувствительности к токсическому действию бромбензола и близких по путям метаболической активации ксенобиотиков. Литература |