МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЇ

УДК 615.9-02:547.539.3:577.158.83

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ГЕПАТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БРОМБЕНЗОЛА И МАРКЕРНЫХ АКТИВНОСТЕЙ ЦИТОХРОМА Р450 И ФЕРМЕНТОВ КОНЪЮГАЦИИ

С.А. Качула, А.А. Пентюк, д.м.н., Е.В. Тертышная, к.б.н., О.Г. Вовк, к.б.н.

Государственный медицинский университет, г. Винница

Токсичность бромбензола в значительной мере определяется путями биотрансформации, поскольку в процессе его окисления появляются електрофильные метаболиты (эпоксиды), оказывающие повреждающее действие на клетки [17]. Кроме того существуют и пути метаболизма, ведущие к образованию неактивных конъюгированных метаболитов с глюкуроновой, серной кислотами и глутатионом [12, 15, 18]. Имеются значительные индивидуальные различия в чувствительности животных к токсическому действию бромбензола [16].

Однако, относительный вклад отдельных изоформ цитохрома Р450 (CYP) и ферментов конъюгации в токсификацию и детоксикацию бромбензола и его метаболитов до настоящего времени не оценен, что сдерживает поиск эффективных способов предупреждения и лечения токсических повреждений печени этим ядом. Целью работы явилось выяснение вопроса, в какой мере гепатотоксический эффект бромбензола детерминируется активностью изоформ цитохрома Р-450 и других ферментов, участвующих в его метаболизме. Для этого в опытах in vivo и in vitro сопоставлялась способность печени крыс к биотрансформации некоторых изоэнзимспецифических субстратов с выраженностью гепатотоксического действия бромбензола.

Материалы и методы исследования

В опытах использовано 237 белых крыс-самцов массой 170-240 г. Способность крыс к метаболизму ксенобиотиков оценивали с помощью тест-препаратов — амидопирина и ацетанилида. Метаболизм амидопирина оценивали по экскреции в течение 12 ч с мочой свободного и ацетилированного 4-аминоантипирина (4-ААП) после его внутрибрюшинного введения в дозе 12,8 мкмоль/100 г массы животного [7]. Метаболизм ацетанилида оценивали по мочевой экскреции за 12 ч его анилидных и аминофенольных метаболитов после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 74 мкмоль/100 г массы [5].

В микросомах печени определяли ацетанилид- и анилингидроксилазную активности по образованию пара-аминофенола; амидопирин-N-, метопролол-0- и эритромицин-N-деметилазные активности — по образованию формальдегида [2]; пара-нитрофенолгидроксилазную активность — по образованию пара-нитрокатехола [14]; ариламидазную активность карбоксилэстеразы [КФ 3.1.1.1] — по гидролизу ацетанилида [11]; активность УДФ-глюкуронилтрансферазы [КФ 2.4.1.17] — по конъюгации пара-нитрофенола [9].

В постмитохондриальной фракции печени оценивали активность фенолсульфотрансферазы [КФ 2.8.2.1] — по образованию сульфоэфира бета-нафтола, используя систему, генерирующую фосфоаденозинфосфосульфат [13]; глутатион-S-трансферазы [КФ 2.5.1.18] — по образованию конъюгатов с 1-хлор-2,4-динитробензолом [10]. В постядерном гомогенате определяли активность N-ацетилтрансферазы [КФ 2.3.1.5] — по конъюгации с пара-аминобензойной кислотой [21].

Гепатоциты получали коллагеназным методом [4], а их жизнеспособность оценивали по окрашиванию трипановым синим, снижению уровня глутатиона (G-SH) и выходу лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [КФ 1.1.1.27] во внеклеточную жидкость при инкубации гепатоцитов в присутствии 0,6 mМ бромбензола в течение 120 мин. Функциональное состояние печени исследовали через 24 ч после перорального введения крысам 1 г/кг бромбензола, исследуя в сыворотке крови активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) [КФ 2.6.1.2] [3], в гомогенате печени — содержание восстановленного глутатиона [8], в микросомной фракции печени активность глюкозо-6-фосфатазы [КФ 3.1.3.9] и уровень малонового диальдегида [1, 6].

Результаты и их обсуждение

В опытах на изолированных гепатоцитах сопоставляли токсический эффект бромбензола с активностью ферментов. Для этого анализ результатов проводили в трех группах гепатоцитов — соответственно с высокой, средней и низкой активностью ферментов, метаболизирующих ксенобиотики (табл. 1). Оказалось, что индуцируемое бромбензолом снижение жизнеспособности гепатоцитов (оценивали по поглощению трипанового синего, выходу ЛДГ и снижению содержания восстановленного глутатиона) в наибольшей степени соответствует маркерным активностям cyp2Е1 (пара-нитрофенолгидроксилаза, анилингидроксилаза), что соответствует данным литературы об участии этого фермента в метаболизме бромбензола [20]. Обнаружена также некоторая зависимость токсичности бромбензола от активности амидопирин-n-деметилазы (cyp2В и 2С). Практически отсутствует связь с маркерными активностями цитохромов cyp1А2, ЗА и 2d. Изучение корреляционных связей между активностью метаболизирующих ферментов и токсичностью бромбензола подтвердило приведенные выше выводы (табл. 2).

Из ферментов конъюгации значительную связь с токсичностью бромбензола проявляют глутатион-S-трансфераза, высокая активность которой совпадает со слабым действием бромбензола на гепатоциты. Это можно объяснить способностью фермента инактивировать токсические метаболиты бромбензола за счет образования аддуктов эпоксидных метаболитов с глутатионом [19]. Другие ферменты (УДФ-глюкуронилтрансфераза, фенолсульфотрансфераза), которые образуют конъюгаты с фенольными и дигидродиольными метаболитами бромбензола (и тем самым усиливают его элиминацию), также способствуют снижению уровня токсического воздействия бромбензола. Активность N-ацетилтрансферазы и карбоксилэстеразы слабо коррелируют с токсичностью бромбензола.

Эти данные показывают, что в условиях in vitro наиболее полно токсический эффект бромбензола проявляется по отношению к гепатоцитам с высокой активностью CYP2Е1, 2В и 2С и, напротив, его токсичность ниже при высокой активности конъюгирующих ферментов. Однако, существует ли подобная зависимость в целостном организме?

Для ответа на этот вопрос мы за 1-2 дня до введения бромбензола оценивали активность ферментов метаболизма ксенобиотиков по экскреции с мочой метаболитов амидопирина и ацетанилида. N-деметилирование амидопирина, как известно, катализируется CYP2В и 2С, а образующийся 4-ААП коньюгируется при участии N-ацетилтрансферазы. Известно, что окисление ацетанилида в пара-ацетиламинофенол осуществляется ферментом CYP1А2, а связывание аминофенольных метаболитов — изоформами УДФ-глюкуронилтрансферазы и фенолсульфотрансферазы. Гидролиз ацетанилида осуществляется одной из изоформ карбоксилэстеразы. В процессе метаболизма ацетанилида при участии CYP2Е1 образуется токсический метаболит N-ацетилбензохинонимин, который после соответствующих превращений экскретируется с мочой в виде меркаптуровых кислот.

По результатам предварительногого тестирования животные также были разделены на группы с высокой, средней и низкой скоростью соответствующих реакций биотрансформации тест-препаратов (табл. 3). Была оценена также сила корреляционной связи между экскрецией метаболитов амидопирина и ацетанилида и гепатотоксичностью бромбензола (табл. 4).

Оказалось, что токсичность бромбензола (оцениваемая по изменению активности сывороточной АлАТ и микросомальной глюкозо-6-фосфатазы, падению уровня восстановленного глутатиона в печени и увеличению содержания малонового диальдегида) наиболее тесно связана со способностью крыс превращать ацетанилид в меркаптуровые кислоты, то есть с активностью CYP2Е1. Данные литературы свидетельствуют, что и бромбензол в организме животных превращается в соответствующие меркаптуровые кислоты [22]. Значительно в меньшей мере токсичность бромбензола оказалась связанной с образованием 4-ААП и пара-аминофенола (эти метаболиты отражают активность CYP2В/2С и CYP1А2, соответственно). Обнаруживалась обратная связь между активностью реакций конъюгации пара-аминофенола с глюкуроновой и серной кислотами и токсичностью бромбензола. Токсическое действие бромбензола оказалось меньшим у животных с высокой способностью к глюкуронидации и сульфатации. В целом данные на животных подтверждают закономерности, обнаруженные в опытах на изолированных гепатоцитах.

Таким образом, использование тест-препаратов позволяет оценить активность отдельных ферментов в целостном организме и выявить особи, более чувствительные к действию бромбензола, а, возможно, и других ксенобиотиков, имеющих сходные с бромбензолом пути биотрансформации.

Полученные данные частично объясняют разную индивидуальную чувствительность животных к бромбензолу, поскольку показывают, что высокий индивидуальный уровень экспрессии цитохрома CYP2Е1, в меньшей мере CYP2В и 2С, определяют более высокую чувствительность крыс к гепатотоксическому действию бромбензола. С другой стороны, высокая активность процессов конъюгации с глюкуроновой и серной кислотами является предиктором большей устойчивости животных к бромбензолу. Очевидно, разработка подходов к прогнозированию, профилактике и лечению токсических поражений печени бромбензолом и другими ксенобиотиками, имеющими сходные пути метаболизма, должна включать тестирование активности цитохрома Р-450 и других метаболизирующих ферментов и целенаправленное воздействие на эти ферменты, например, с помощью селективных ингибиторов и индукторов.

Выводы

1. Инкубация бромбензола с гепатоцитами крыс вызывает снижение запасов восстановленного глутатиона, выход из клеток лактатдегидрогеназы и их прокрашивание трипановым синим. Высокая активность в печени крыс СYP2Е1 усиливает повреждающее действие бромбензола, а высокая активность глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы и фенолсульфотрансферазы, напротив, уменьшает его. Токсичность бромбензола слабо коррелирует с активностью CYP1A2, 2B и 2C, карбоксилэстеразы и N-ацетилтрансферазы.

2. Крысы с высокой способностью к превращению ацетанилида в меркаптуровые кислоты отличаются более высокой чувствительностью к токсическому действию бромбензола, тогда как животные с повышенной способностью метаболизировать ацетанилид с образованием глюкуронидных и сульфатных метаболитов отличаются большей устойчивостю к бромбензолу.

3. Предварительное тестирование животных с помощью ацетанилида и амидопирина позволяет выявить особи с различной чувствительностью к бромбезолу, и этот подход может быть использован для прогнозирования индивидуальной чувствительности к токсическому действию бромбензола и близких по путям метаболической активации ксенобиотиков.

Литература
1. Владимиров Ю.В., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. —М.: Наука, 1972. —252 с.
2. Карузина И.И., Арчаков А.И. Выделение микросомальной фракции печени и характеристика ее окислительных систем //В кн. "Современные методы в биохимии". —М.: Медицина, 1977. —С. 49-62.
3. Лабораторные методы исследований в клинике. Под ред. В.В.Меньшикова. —М.: Медицина, 1987. —368 с.
4. Осипова Л.А., Иващенко Ю.Д., Немлий Н.И., Быкорез А.И. Стимуляция синтеза ДНК в гепатоцитах фракциями сыворотки крови крыс // Биополимеры и клетка. —1986. —№ 3. —С. 141-146.
5. Пентюк А.А., Луцюк Н.Б., Гуцол В.И., Яковлева О.А., Лычик Г.З. Ацетанилид как модельный препарат для изучения процесов метаболизма чужеродных веществ //Вопросы мед. химиии… Депонир. ВИНИТИ 07.06.1990, № 3165 —В 90, 11 с.
6. Покровский А.А., Арчаков А.И. Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций //Современные методы в биохимии. —М.:Медицина, 1968. —С. 5-59.
7. Попов Т.А., Леоненко О.Б. Метод оценки активности оксидаз печени //Гигиена и санитария. —1977. —№ 9. —С. 23-26.
8. Asaoka K., Takahashi K. An enzymatic assay of reduced glutathione usingglutathione S-aryltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate. //J. Biochem. —1981. —V. 90, № 5. —P. 1237-1242.
9. Burchell R., Weatheril P. 4-nitrophenol UDP-glucuronosyltransferase //Meth/ Enzymol. —1981. —V. 77. —Р. 169-177.
10. Habig W.H., Jacobi W.B. Assays for differentiation of glutathione-S-transferase // Meth. Enzymol. —1981. —V. 77. —Р. 398-405.
11. Heymann E., Mentlein R., Rix H. Hydrolisis of aromatic amides as assay for carboxylesterase-amidases //Meth.Enzymol. —1981. —V. 77. —Р. 405-409.
12. Hinson J.A., Forkert P.G. Phase II enzymes and bioactivation. //Can J Physiol Pharmacol. —1995 —Oct 73(10). —Р. 1407-13.
13. Kempen G.M., Jansen G.S. Enzymatic sulfatation of 4-methylumbelliforne //Experientia. —1971. —V. 27, № 4. —Р. 485-486.
14. Koop D.R. Hydroxylation of p-nitrophenol by rabbit ethanol-inclucible cytochrome P-450 isozyme //Mol. Pharmacol., —1986. —V. 29, № 4. —Р. 399-404.
15. Madhu C., Klaassen C.D. Bromоbenzene-glutatione excretion into bile reflects toxic activation of brombenzene in rats. //Toxicol Lett. —1992. —V. 60, № 2. —Р. 227-236.
16. Mennes W.C., van Holsteijn C.W., van Iersel A.A., Yap S.H., Noordhoek J., Blaauboer B.J. Interindividual variation in biotransformation and cytotoxicity of bromobenzene as determined in primary hepatocyte cultures derived from monkey and human liver. //Hum Exp Toxicol. —1994. —Jun 13(6). —Р. 415-21.
17. Rombach E.M., Hanzlik R.P. Detection of adducts of bromobenzene 3,4-oxide with rat liver microsomal protein sulfhydryl groups using specific antibodies. Chem Res Toxicol. —1999. —Feb 12 (2). —P. 159-63.
18. Schnellmann R.G., Monks T.J., Mandel L.J., Lau S.S. 2-Bromohydroquinone-induced toxicity to rabbit renal proximal tubules: the role of biotransformation, glutathione, and covalent binding. //Toxicol Appl Pharmacol. —1989. —Jun 99(1). —Р. 19-25.
19. Wang B.H., Zuzel K.A., Rahman K., Billington D. Protective effects of aged garlic extract against brombenzene boxicity to precision cut rat liver slices. //Toxycology. —1998. —V. 126, № 3. —P. 213-222.
20. Wang R.S., Nakajama T., Honma T. Different chage pattersnt of the isozymes of cytochrome P-450 and glutatione S-transferases in chemically induced liver damage in rats. //Ind. Health. —1999. —V. 37, № 4. —Р. 440-448.
21. Weber W.W.,King C.M. N-acetyltransferase and Arylhydroxamic Acid acyltransferase //Meth.Enzymol. —1981. —V. 77. —P. 272-281.
22. Zheng I., Hanzlik R.P. Digydroxylated mercapturic acid metabolites of brombenzene. //Chem. Res.Toxycol. —1992. —V. 5, № 4. —Р. 561-567.


| Зміст |