|
МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЇ УДК 577. 152. 199.1 ИНДУКЦИЯ ИЗОФОРМ 1А1, 1А2 И 1В1 ЦИТОХРОМА Р450 И АКТИВАЦИЯ ПОЛИ-(АДФ-РИБОЗО)-ПОЛИМЕРАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС, ВЫЗВАННЫЕ ФИТОЭСТРОГЕНАМИВ.В. Сумбаев, к.б.н., И.М. Ясинская Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова, Украина Изоформы цитохрома Р450 1А1, 1А2 и 1В1 являются наиболее важными среди представителей данного суперсемейства, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков. Их индукторами являются полихлорированные ароматические углеводороды (ПАУ) - полихлорбифенилы, полихлордибензодиоксины и полихлордибензофураны, которые метаболизируются указанными ферментами [1, 2]. При попадании в организм ПАУ проявляют мощную эстрогенную активность — большую, нежели природные стероидные эстрогены. Они хорошо проникают в клетки и 90 % попавших в организм ПАУ в конечном счете накапливаются в печени [3]. В клетках печени ПАУ взаимодействуют с Ah-рецепторами. Комплекс Аh-рецептор-ПАУ активирует экспрессию генов, кодирующих изоформы 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 [1, 3]. Кроме того, лиганд-Аh-рецепторный комплекс частично фосфорилируется протеинкиназой С и проявляет митогенную активность [4]. Все лиганды Ah-рецепторов тормозят апоптоз клеток, ингибируя активность ксантиноксидазы (генератор активных форм кислорода — АФК) и синтазы оксида азота (генератор NO) [5, 6]. Супероксидные радикалы и другие АФК так же, как и NO индуцируют активность апоптогенного белка р53 и дисфункцию митохондрий. В результате дисфункции митохондрий цитохром-с выходит из них и связывается с фактором 1, активирующим апоптогенные протеиназы (Apaf-1), и каспазой-9 [7]. Образующийся комплекс вызывает активацию каспазы-3, а также каспаз -6 и -7 [7]. Активированные каспазы расщепляют поли-(АДФ-рибоза)-полимеразу (ПАРП) [8]. ПАРП (КФ: 2.4.2.30) — это протеин с молекулярной массой 116 кДа, необходимый для репарации ДНК. Он синтезирует поли-АДФ-рибозу из NAD+ [7, 8]. Образованный полимер связывается с гистоновыми белками хроматина и осуществляет репарацию фрагментированной ДНК [7, 8]. Известно, что фитоэстрогены — изофлавоны генистеин и даидзеин имеют структурное сходство с полихлорбифенилами, полихлордибензодиоксинами, что позволяет им взаимодействовать с рецепторами эстрогенов и проявлять эстрогенную активность [9]. С другой стороны, данные соединения ингибируют протеинкиназу С и все тирозиновые протеинкиназы, тормозя тем самым пролиферацию клеток [10]. В связи с этим вызывает интерес взаимодействуют ли описанные фитоэстрогены с Ah-рецепторами, индуцируя изоформы 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450, и оказывают ли они влияние на активность ПАРП как ингибиторы синтазы оксида азота и ксантиноксидазы. Целью настоящей работы явилось изучение суммарного содержания изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450, а также активности ПАРП в печени крыс при введении генистеина и даидзеина. Материалы и методы исследованя В опытах использовали 18 крыс-самцов линии Вистар в возрасте 5 мес и массой 200±30 г. Данное потомство было получено от скрещивания одного и того же самца с тремя разными самками. Животных делили на три группы (по 6 крыс): 1 группа была интактной, животные 2 группы получали по 300 мкг/кг генистеина, а 3 — по 300 мкг/кг даидзеина. Нагрузки производили перорально в течение 30 дней. Через 2 ч после последней инъекции крыс декапитировали и немедленно изолировали печень (наибольшую удельную активность изоформы 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 и NO-синтаза проявляют именно в этом органе), гомогенизировали в 0,25 М водном растворе сахарозы. Из гомогенатов выделяли ядра и микросомы при помощи дифференциального центрифугирования. Из полученных микросом печени элиминировали белки при помощи натрия холата [2] и разделяли при помощи диск-электрофореза в ПААГ. Количество изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 определяли по описанной нами ранее методике [2]. Готовили экстракт ядерных белков и разделяли его при помощи электрофореза в 2 % агарозном геле, после чего в них определяли количество поли-(АДФ-рибозы) [11]. Активность ПАРП выражали в мкмоль АДФ-рибозы на 1 мг белка. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с t-критерием Стьюдента. Результаты и их обсуждение В печени крыс, получавших генистеин и даидзеин, суммарное содержание изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 было значительно повышено (таблица). Причем у крыс, получавших генистеин, содержание данных изоформ было примерно в 2 раза выше, чем у животных, получавших даидзеин. Эти результаты свидетельствуют о том, что генистеин и даидзеин являются индукторами данных изоформ цитохрома Р450. Так как индукция биосинтеза изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 осуществляется исключительно через ah-рецепторы [1], то ясно, что исследованные нами фитоэстрогены взаимодействуют с ними подобно ПАУ. Активность ПАРП при этом также достоверно повышалась (таблица), из чего можно заключить, что исследуемые фитоэстрогены оказывают тормозящее действие на апоптоз клеток печени, так как при апоптозе активность ПАРП значительно снижается, а иногда даже полностью отсутствует [7]. Активность ПАРП повышается при повреждениях и фрагментации ДНК. Следовательно, в данном случае имело место повреждение ДНК. Как полифенолы, генистеин и даидзеин практически не гидроксилируются изоформами цитохрома Р450, поэтому большое количество ферментов не взаимодействует с субстратом. Как известно, свободный цитохром Р450, не реагирующий с субстратом, принимает электроны и передает их молекулярному кислороду с образованием свободных супероксидных радикалов [3]. Свободные супероксиды являются агентами, вызывающими множественные повреждения ДНК [3], что, естественно, сопровождается активацией ПАРП. Как видно из полученных нами результатов, активность ПАРП возрастает пропорционально содержанию изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что генистеин и даидзеин являются индукторами изоформ 1А1, 1А2 и 1В1 цитохрома Р450 и подавляют активность ПАРП в печени крыс Литература |