УДК 577.1:578.083:612.4.42

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА, ИОНОВ АММОНИЯ, МОЧЕВИНЫ В МЕХАНИЗМЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ N-НИТРОЗОДИМЕТИЛАМИНА

Л.Н. Смердова, Н.П. Дмитренко, д.б.н.

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев

Изучение механизмов цитотоксического действия ксенобиотиков является одним из ведущих направлений современной токсикологии. Особый интерес в этом аспекте представляют макрофаги как ключевые клетки в иммунном ответе. Известно, что макрофаги под действием химических и других факторов гибнут по типу апоптоза [1], для которого характерно последовательное развитие определенных цитоморфологических признаков — сжатие клетки, конденсация цитоплазмы, маргинация хроматина, кариорексис, повреждение ядерной оболочки, в конечном итоге — распад клетки с образованием апоптотических телец [2], и биохимических реакций, контролируемых и регулируемых различными метаболитами [3]. В последнее время важную роль в развитии апоптоза придают оксиду азота. В физиологических условиях NO выступает важным внутриклеточным мессенджером, который действует через цГМФ-зависимый механизм. В патологических условиях, например, при воспалении, образование NO может увеличиваться в сотни раз, становясь токсичным для разных типов клеток и, тем самым, индуцируя апоптоз [4, 5]. Наиболее чувствительными к NO являются макрофаги. В то же время непрямые данные показывают, что и антиапоптотические механизмы могут быть NO-зависимыми. Принципиальная возможность NO угнетать апоптоз была продемонстрирована на некоторых линиях клеток: лимфоциты, эозинофилы, гепатоциты. Кроме того, способность NO угнетать апоптоз была установлена в опытах in vivo [6].

Метаболизм оксида азота, мочевины и аммиака взаимосвязаны и определяется энергетическим состоянием клетки. При уменьшении энергетического и восстановительного потенциала снижается синтез оксида азота и мочевины и возрастает образование аммиака, основным источником которого служат аденозиндезаминазная, АМФ-аминогидролазная и глутаминазная реакции [7]. В активированных макрофагах наряду с NO-синтазой активируется аргиназа. В таких условиях аргиназа может конкурировать с NO-синтазой за их общий субстрат аргинин и даже ингибировать NO образование. Синтез NO может быть уменьшен за счет истощения аргиназой фонда общего субстрата аргинина [8].

Аммиак, выделяющийся при дезаминировании аминокислот, претерпевает превращения в цикле мочевины; в реакции с оксидом углерода образует карбамоилфосфат — исходное соединение в цикле мочевины, а с аспарагиновой кислотой — в синтезе пиримидинов.

В литературе отсутствуют данные о роли взаимодействия оксида азота, ионов аммония, мочевины в механизме цитотоксического действия на макрофаги ксенобиотиков.

В настоящей работе исследовали в опытах in vіtro на модели апоптоза перитонеальных макрофагов крысы, вызванного N-нитрозодиметиламином (широко распространенный загрязнитель с ярко выраженными канцерогенными, мутагенными и цитотоксическими свойствами), участие оксида азота, ионов аммония, мочевины в реализации цитотоксического действия этого нитрозосоединения.

Материалы и методы исследования

В работе использованы среда RPMI-1640, аргинин, канаванин, тиопролин, валин, глутамин, гипоксантин фирмы "Sigma" (США).

Опыты проводили на белых крысах-самцах массой 150-180 г. Для активации перитонеальных макрофагов животным внутрибрюшинно вводили вакцину БЦЖ в дозе 1 мг на 100 г массы тела. На 7-10 сут крыс декапитировали под эфирным наркозом. Выделение макрофагов осуществляли, используя среду RPMI 1640, забуференную Na₂HCO₃ до рН 7,3 [9]. Полученную суспензию клеток разливали по 1,0 мл в 24-луночные пластиковые планшеты, добавляли по 75 ЕД пенициллина и стрептомицина, 5 % инактивированную сыворотку телят, исследуемые эффекторы и инкубировали при 37°С в СО₂ — инкубаторе (5 % СО₂). Изучение влияния эффекторов проводили на активированных перитонеальных макрофагах с НДМА (0,1 мкг/мл) и без него. Через 6 часов проводили подсчет живых и мертвых клеток, окрашивая их трипановым синим, и определяли количество оксида азота, ионов аммония, мочевины. Уровень нитритов в среде инкубации клеток определяли с помощью реактива Грисса [10] модифицированным нами методом [11]. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева. Содержание мочевины определяли флуоресцентным методом: к 10 мкл надосадочной культуральной жидкости макрофагов добавляли 100 мкл буферного раствора уреазы, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, добавляли 3 мл реагента (750 мМ раствор О-фтальальдегида в абсолютном этаноле, 72 мМ раствор бета-меркаптоэтанола в этаноле и 0,2 М фосфатный буфер рН 7,4 в соотношении 1:1:18). Перемешивали при комнатной температуре, инкубировали 30 мин до образования продукта со стабильной флуоресценцией. Определение количества образовавшихся ионов аммония проводили на флуориметре при (лямбда)-возбуждения 410 нм и (лямбда)-флуоресценции 470 нм [12].

Содержание ионов аммония определяли флуоресцентным методом [13]. Цитоморфологические исследования проводили общепринятым методом [14]. Клеточную суспензию раскапывали на предметные стекла, фиксировали и окрашивали по методу Паппенгейма-Крюкова. Полученные препараты анализировали под масляной иммерсией при увеличении 1000 раз, используя (микроскоп "Axioskop", Германия).

Расчеты коэффициента корреляции и статистический анализ результатов по t-критерию Стьюдента проводили с использованием программ Statistika, Excel.

Результаты и их обсуждение

Проведенные нами цитоморфологические исследования показали, что перитонеальные макрофаги под действием НДМА гибнут по типу апоптоза. Наблюдаются характерные для апоптоза морфологические признаки: сжатие клетки с последующей фрагментацией ядра и конденсацией цитоплазмы, а позднее — фрагментация клетки.

Действие НДМА на неактивированные и активированные макрофаги вызывает зависимое от дозы повышение синтеза ионов аммония и мочевины, а также увеличение количества погибших клеток. Выявлена высокодостоверная корреляция между степенью накопления ионов аммония и мочевины, с одной стороны, и ростом числа погибших клеток, — с другой. Также обнаружены сильные корреляционные связи между концентрацией НДМА и: гибелью макрофагов (коэффициент корреляции — 0,959 для неактивированных, 0,957 — для активированных), синтезом ионов аммония (0,905 и 0,934, соответственно), мочевины (0,903 и 0,948, соответственно).

Усиление образования ионов аммония и мочевины, очевидно, относится к ранним проявлениям гибели клеток, вызванной НДМА, поскольку наиболее резко возрастает в течение первого часа инкубации с момента добавления НДМА к макрофагам (синтез ионов аммония возрастает в 2,3 раза, мочевины — в 2,5 раза при концентрации НДМА 1 мкг/мл).

Для выяснения взаимосвязи между гибелью макрофагов, вызванной НДМА, образованием мочевины, ионов аммония и NO, мы меняли содержание последнего путем усиления его синтеза либо связывания соответствующими акцепторами. Ранее нами показано [15], что синтез NO в перитонеальных макрофагах существенно возрастает при активации клеток путем иммунизации крыс вакциной БЦЖ и добавлении к макрофагам аргинина — субстрата NO-синтазы. Поэтому нельзя исключить, что снижение уровня наработки мочевины и аммония в активированных макрофагах и большая их уязвимость к цитотоксическому действию НДМА может определяться усилением синтеза NO.

Аргинин в различных концентрациях по-разному влияет на уровень накопления изучаемых метаболитов и жизнеспособность активированных макрофагов (рис. 1, табл.1). При увеличении концентрации до 8 мМ эффектор усиливает синтез no, ионов аммония и мочевины. Аргинин в низких концентрациях (2-8 мМ) не проявляет цитотоксического действия и способствует выживаемости макрофагов даже при действии НДМА. При концентрации аргинина 32 мМ уровни no и ионов аммония снижаются до исходных величин, а количество мочевины в клеточной суспензии остается повышенным. Гибель клеток при этих концентрациях аргинина существенно увеличивается. В присутствии НДМА сохраняется та же направленность изменений образования исследуемых метаболитов. Цитотоксическое действие высоких концентраций аргинина и НДМА суммируется.

Механизм цитотоксического действия высоких доз аргинина не изучен, в то же время протекторные свойства низких, физиологических концентраций аргинина в отношении различных типов клеток отмечают многие исследователи [16, 22]. Это связано с его известной ролью в синтезе полиаминов, ключевых ферментов, гормонов, протаминов и гистонов. Аргинин является субстратом для циклов Кребса и мочевины, NO-синтазы и аргиназы; необходим для функционирования ядер и митохондрий.

В отличие от аргинина, канаванин и тиопролин могут снижать уровень NO. Канаванин является оксигуанидиновым производным аргинина, ингибитор широкого действия аргинин-утилизирующих ферментативных реакций, в первую очередь ингибирует NO-синтазу и аргиназу [17]. Тиопролин представляет собою аминокислоту, содержащую SH-группу. Он — малотоксичен и способен ковалентно связывать NO, образуя соответствующее N-нитрозосоединение, которое не денитрозируется цитохромом Р-450, вследствие чего не обладает канцерогенными свойствами. В то же время способность тиопролина нитрозироваться на два порядка выше, чем для других предшественников N-нитрозосоединений — вторичных и третичных аминов, может быть использована для снижения повышенного уровня NO в организме [18]. Оба эти соединения самостоятельно и в присутствии НДМА эффективно снижают уровень NO в среде инкубации активированных перитонеальных макрофагов и оказывают зависимое от концентрации цитотоксическое влияние на клетки. Но канаванин при этом заметно усиливает синтез ионов аммония, а тиопролин практически не влияет на образование ионов аммония и мочевины. При комбинированном действии НДМА с канаванином наблюдается аддитивность эффекта, а с тиопролином — эффект по цитотоксичности ниже аддитивного (рис. 2, 3, табл. 2, 3).

Таким образом, при однонаправленности действия на синтез NO макрофагами влияние канаванина и тиопролина на другие показатели неодинаково, что можно объяснить отсутствием взаимосвязи между изучаемыми процессами и тем, что канаванин и тиопролин оказывают действие на жизнеспособность клеток через механизмы, не связанные с синтезом NO. Тиопролин тесно связан с обменом формальдегида и цистеина, являясь продуктом их взаимодействия в клетках, что также может обусловливать особенности его цитотоксического эффекта.

Аминокислота валин, являющаяся ингибитором аргиназы — фермента, осуществляющего гидролиз аргинина с образованием мочевины [8], как в присутствии НДМА, так и без него, снижает накопление мочевины в 4,5 раза (при концентрации 16 мМ) и ионов аммония — в 1,9 раз (рис. 4). Валин, не влияя на гибель макрофагов в присутствии НДМА, сам по себе проявляет высокую цитотоксичность (гибель клеток увеличивается в 1,8 раз при 16 мМ табл. 3). Возможно, такие изменения связаны с тем, что валин, ингибируя цикл мочевины и уменьшая энергетические затраты на его функционирование, тем самым способствует сохранению фонда АТФ и снижению скорости катаболизма адениннуклеотидов, являющихся основным источником аммиакообразования в клетке.

Важное место в обмене азотсодержащих веществ в организме принадлежит глутамину, растворимому и нетоксичному переносчику дополнительного количества аммиака. Под действием активной синтазы из глутамата и аммиака образуется глутамин, амидный азот которого используется в многочисленных биохимических процессах, в т.ч. в образовании карбамоилфосфата, глюкозамина, NAD⁺, пуринов, п-аминобензоата, гистидина. Глутамин играет центральную роль в удалении азота из органических соединений. Будучи реакцией обратимой, переаминирование обычно служит начальным этапом катаболизма избыточного уровня аминокислот. В результате присоединения азота к кетоглутарату образуется избыточный глутамат, который дезаминируется с образованием аммиака и далее — глутамина. Глутамин способен отдавать свой азот на образование аспартата. Образование глутамата в результате восстановительного аминирования представляет собой основной путь включения азота в состав аминогрупп, хотя не исключено существование других путей [19]. Проведенные нами исследования показали (рис. 5, табл. 3), что глутамин усиливает синтез no, проявляет тенденцию к снижению уровня ионов аммония; при концентрации 8 мМ уменьшает уровень мочевины в 1,3 раза, по мере увеличения концентрации (до 16 мМ) количество мочевины возвращается к исходному уровню. Высокие дозы глутамина усиливают гибель макрофагов, т.к в результате глутаминазной реакции высвобождается токсичный аммиак: активность глутаминазы в клетках сосредоточена, главным образом, в ядрах и митохондриях [20], где локальное образование даже малых количеств аммиака может играть важную роль в запуске апоптоза.

Гипоксантин через реутилизационный путь обмена пуринов может улучшать энергоснабжение клеток, что необходимо и для синтеза NO, и для утилизации ионов аммония, и для синтеза мочевины. Эффектор вызывает зависимую от концентрации гибель макрофагов, что сопровождается накоплением NO, ионов аммония и, в меньшей степени, мочевины (рис. 6, табл. 3). Такое цитотоксическое действие гипоксантина можно объяснить тем, что он является субстратом ксантиноксидазной реакции, одним из продуктов которой — супероксид, обладающий сильным повреждающими действием на клетки [21] и способностью блокировать дальнейшее использование образовавшихся метаболитов (оксида азота, ионов аммония, мочевины). При совместном действии гипоксантина и НДМА цитотоксический эффект менее, чем аддитивный, что, по-нашему мнению, можно объяснить конкуренцией за мишени действия.

Таким образом, проведенными исследованиями установлено, что такие ключевые метаболиты как оксид азота, ионы аммония, мочевина, не являясь активными участниками апоптотической гибели перитонеальных макрофагов, играют важную регуляторную роль в механизме развития цитотоксического действия N-нитрозодиметиламина.

Литература
Y. Ranjan P., Sodhi A., Singh S.M. Murine peritoneal macrophages treated with cisplatin and interferon-gamma undergo NO-mediated apoptosis via activation of an endonuclease. // Anticancer Drugs. —1998, —9(4). —P. 333-341.
2. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз: краткая история, молекулярные механизмы, методы выявления и возможное значение в онкологии // Экспер. онкология. —1996. —№18. —С. 435-448.
3. Матышевская О.П. Биохимические аспекты вызванного радиацией апоптоза // Укр.биохим.журн. —1998, —Т. 70, №5. —С. 15-29.
4. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Вольский Н.Н.,.Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз. // Успехи современной биологии. —1999. —Т. 119, №5. —С. 440-450.
5. M'hammed Sarih, Vongthip Souvannavong and Arlette Adam. Nitric oxide synthase induces macrophage death by apoptosis // Bioch.and bioph. res com. —1993, —V. 191, N2. —Р. 503-508.
6. Малышев И.Ю., Монастырская Е.А., Смирин Б.В., Манухина Е.Б. Гипоксия и оксид азота. // Вестник РАМН. —2000. —N 9. С. 44-48.
7. Козлов Н.Б. Аммиак. Его обмен и роль в патологии. М.:"Медицина", 1971. —С. 127.
8. Chang CI, Liao JC, Kuo L. Arginase modulates nitric oxide production in activated macrophages // Am. J. Physiol. —1998. —274 Р. 342-348.
9. Лимфоциты. Методы / Под ред. Дж.Клауса.-М: Мир, 1990. —401 с.
10. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J.G. Analysis of nitrate, nitrite and 15N-nitrate in biological fluids // Anal.Biochem. —1982. —126, N. 1. —Р. 131-138.
11. Дмитренко Н.П., Сноз С.В., Смердова Л.Н. и др. Влияние акцепторов оксида азота на критериально значащие биохимические показатели у крыс с нитритной нагрузкой. // Соврем. проблемы токсикол. —1998. —№1. —С. 24-28.
12. Richard J.Roman, Joseph V.Bonventre, Claude P. Lechene. Fluorometric assay for urea in urine, plasma, and tubular fluid // Anal. Biochem. —1979. —V. 98. —P. 136-141.
13. S.Taylor, V.Ninjoor, D.M.Dowd et al. Cathepsin B2 measurement by sensitive fluorometric ammonia analysis//Anal.Biochem. —1974. —60. —Р. 153-162.
14. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е.А. Кост. // М. Медицина, 1975. —383 с.
15. Смердова Л.Н., Кишко Т.О., Паршиков А.В., Дмитренко Н.П. Изучение влияния некоторых метаболитов на синтез оксида азота перитонеальными макрофагами крыс. // Укр.биохим.журнал. —1999. —Т. 71, №3. —С. 30-34.
16. Li XS, Uriuda Y, Wang QD, Norlander R, et al. Role of L-arginine in preventing myocardial and endothelial injury following ischaemia/reperfusion in the rat isolated heart // Acta Physiol. Scand. —1996. —V. 156, —Р. 37-44.
17. Hrabak A., Bajor T., Temesu A. Comparison of substrate and inhibitor specificity of arginase and nitric oxide (NO) synthase for arginine analogies and related compounds in murine and rat macrophages. // Bioch.and bioph. res com. —1994. —V. 198. —N1. —P. 206-212.
18. Miwa M, Tsuda M, Kurashima Y. Macrophage —mediated N-nitrosation of thioproline and proline // Biochem. Biophys. Res. Commun. —1989. —V. 159. —№2. —Р. 373-378.
19. Murphy C, Newsholme P. Importance of glutamine metabolism in murine macrophages and human monocytes to L-arginine biosynthesis and rates of nitrite or urea production. // Cli Sci (Colch). —1998. V. 95, №4, —Р. 397-407.
20. Бекир-Заде Г.М. Данные по изучению амидного азота в гладких мышцах. // Автореф. дисс… канд. наук, —1967, —16 с.
21. Xia Y., Zweier J.L. Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric oxide synthase in macrophages // Proc Natl Acad Sci USA. —1997. —V. 94, №13 —Р. 6954-6958.
22. Schmidt H.W., Nau H., Wittfoht W. et al. Arginine is physiological precursor of endothelium-derived nitric oxide // Europ. J. of Pharmacology —1988. —154, N 2. —P. 213-216.