УДК 577.352.33.012

ВПЛИВ ДЕЯКИХ ПОХІДНИХ ПІРИДИНКАРБОНОВИХ КИСЛОТ НА СТРУКТУРНУ МОДИФІКАЦІЮ ІЗОЛЬОВАНИХ МЕМБРАН ЕНДОПЛАЗМАТИЧНОГО РЕТИКУЛУМУ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ ІНТОКСИКАЦІЇ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

Ю.І. Губський, Г.Г. Горюшко, Н.В. Литвинова, Р.Г. Примак, В.П. Даниленко, Н.М. Курська, Т.М. Курапова, О.М. Величко

Інститут фармакології та токсикології АМН України, м. Київ

Проведені раніше дослідження [5, 12, 18] свідчaть про перспективність похідних піридинкарбонових кислот (ПКК) як ефективних засобів захисту мембран. Однією з особливостей дії похідних ПКК є їх здатність інгібувати вільнорадикальні реакцї перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). У дослідах in vivo на класичній моделі ПОЛ — інтоксикації тетрахлорметаном (ТХМ) при вивченні фракцій ядерного хроматину та мембран ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) печінки щурів виявлено геномозахисну та мембраностабілізуючу дію похідного ПКК — амізону [6]. Представники похідних ПКК амізон, сполука ПВ-4, та у меншому ступені, ПВ-3 показали антиокислювальну активність при вивченні у дослідах in vitro залізоініційованої біохемілюмінесценції (БХЛ) ліпопротеїнів яєчного жовтка [4], а також за умов індукованого NADPH та аскорбатом ПОЛ в мембранах ЕР клітин печінки [7].

Мета роботи — вивчити здатність похідних ПКК ПВ-3, ПВ-4 у порівнянні з амізоном впливати на структурну модифікацію та антиокислювальні властивості ізольованих мембран ЕР печінки щурів за умов дії гепатотоксину тетрахлорметану.

Матеріали та методи дослідження

Досліджували похідні ПКК: 4-(N-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид (амізон), хлоргідрат метилового ефіру О-ізонікотиноїл-саліцилової кислоти (ПВ-4), та хлоргідрат N-бензиламіда ізонікотинової кислоти (ПВ-3), що синтезовані у Інституті фармакології та токсикології АМН України [14]. Дослідження проводили на щурах-самцях лінії Вістар масою тіла 160-200 г. ТХМ вводили внутрішньоочеревинно у дозі 1 ЛД₅₀ (1,75 мл/кг маси тіла). Водні розчини досліджуваних сполук (ДС) вводили також внутрішньоочеревинно у дозі 1/10 ЛД₅₀ за 24 год до отруєння та через 1 год після отруєння тварин ТХМ. Експерименти проводили через 24 год після введення отрути. Препарати ЕР (мікросомальну фракцію) з печінки щурів виділяли за методом диференціального центрифугування [11], концентрацію білка в них визначали за методом [19]. Загальні ліпіди мікросомальної фракції печінки визначали у хлороформ-метанольних екстрактах, одержаних за методом Фолча, сульфофосфорнованіліновим методом із застосуванням стандартних наборів фірми "Лахема" (Чехія) у мікромодифікації [17].

Контрольну групу складали інтактні тварини. Дослідні були поделені на дві групи: отруєні ТХМ та отруєні ТХМ на фоні лікувально-профілактичного введення однієї з ДС.

Антиокислювальну дію сполук у мембранах ЕР, отриманих з печінки контрольних да дослідних груп тварин, вивчали за методом залізоініційованої біохемілюмінесценції (БХЛ) при 37°С, вимірюючи інтенсивність швидкого спалаху (I₁, відн. од.) та площу світлосуми (S, імп.) за період 3 хв з моменту введення в суспензію мікросом розчину FeSO₄ (1 мМ). Розчин FeSO₄ у 0,01 н. HCl готували ex tempore для уникнення аутоокислення Fe²⁺ [3]. Виміри проводили на біохемілюмінометрі БХЛ-06 з ФЕП-79.

Взаємодію ДС з мембранами ЕР вивчали спектрофотометрічно[16]. Диференціальні спектри поглинання ДС визначали як зміну оптичної щільності DД_l=Д_М+ДС-Д_ДС-Д_М, де Д_М+ДС, Д_ДС та Д_М оптична щільність суміші мембран та ДС, тільки ДС та тільки мембран, відповідно, на довжині хвилі l. Концентрація у суспензіях ізольованих мембран білку становила 0,25 мг/мл. Структурні зміни у мембранах ЕР при інтоксикації ТХМ та під впливом ДС вивчали за методами флуоресцентного зондування [2, 10] глибинним зондом піреном (метод індуктивно-резонансного переносу енергії (IРПЕ, l_зб=286 нм), індикатором позитивно заряджених e-аміногруп залишків лізину — флуорескаміном (ФК, l_зб=390 нм, час інкубації ФК у мембранах 1,5 год [20]), а також за методом гасіння білкової флуоресценції (l_зб=286 нм) зовнішнім дифузійним гасником акриламідом [9]. Величину абсолютної біодоступності (БД, %) досліджуваних сполук оцінювали згідно з [13] як функцію зворотної величини константи зв'язування ДС з сироватковим альбуміном людини (САЛ). Статистичну обробку одержаних експериментальних даних проводили згідно з [1].

Результати та їх обговорення

Результати дослідження залізоініційованої БХЛ суспензії мембран ЕР печінки з інтактних тварин in vitro (рис.1) свідчать, що за показником швидкого спалаху БХЛ (i₁) антиокислювальна дія сполуки ПВ-3 майже відсутня. Сполука ПВ-4 виявляє антиоксидантну дію, найбільш відчутну за умов тестування у концентраціях 10^-7—10^-6 М, при підвищенні концентрації до 10^-5—10^-4 М така дія дещо зменшується, але на відміну від амізону [12], сполука ПВ-4 при даних концентраціях не виявляє прооксидантної дії. Аналогічним чином змінюється і інший показник БХЛ — площа світлосуми (s), а саме, при дії сполуки ПВ-4 у концентраціях 10^-7 М та 10^-4 m цей показник дорівнює s=2032±87 імп. та 2392±106 імп., відповідно, (в контролі s=2661±111 імп). У звязку з відсутністю антиоксидантної дії у сполуки ПВ-3 при дослідах in vitro, дослідження залізоініційованої БХЛ мембран in vivo проводили лише для сполуки ПВ-4.

Результати дослідів in vivo для мембран ЕР печінки контрольної та дослідної груп тварин показали, що отруєння ТХМ активує вільнорадикальні процеси: значення І₁ та S вірогідно зростають порівняно з контролем з 15,0±0,4 ум.од. до 23,0±1,0 ум.од. та з 2694±66 імп. до 3394±100 імп., відповідно. Введення отруєним тваринам сполуки ПВ-4 сприяє нормалізації даних параметрів: значення I₁ та S дорівнюють, відповідно, 14,6±1,2 ум.од. та 2801±91 імп. Таким чином, сполука ПВ-4, так само як і амізон [12], має антиоксидантні властивості у мембранах ЕР печінки, що призводить до корекції показників БХЛ, порушених за умов інтоксикації ТХМ. Вивчення механізму дії фармакологічних засобів захисту передбачає отримання інформації, що характеризує структурно-функціональну організацію мембран, вплив цих сполук на показники, які визначають властивості поверхні, глибинних (гідрофобних) зон фосфоліпідного бішару, здатність до комплексоутворення з компонентами біомембран.

На рис. 2 наведено диференціальні спектри поглинання амізону, сполук ПВ-3 та ПВ-4 (а, б та в, відповідно) в координатах dД_l-l після інкубації їх у середовищі суспензій мікросомальних мембран в tris hcl буфері in vitro (рН 7,4). Зміни оптичної щільності dД_l, що спостерігалися у спектрах поглинання розчинів зазначених сполук, інкубованих у середовищі мембран ЕР печінки інтактних щурів, отруєних ТХМ, та після лікувально-профілактичного введення ціх сполук, свідчать про взаємодію з мембранами. У довірчій для вимірів dД_l ділянці спектрів амізону значення dД_l у випадку мембран, що досліжувалися, мають від'ємний знак (гіпохромний ефект), тоді як для ПВ-3 у випадку інтактних та отруєних щурів (рис. 2б, криві 1, 2) спостерігається гіперхромний ефект. Але для амізона та його структурного аналога сполуки ПВ-3 введення отруєним тваринам супроводжується зміною dД_l у ділянці 220-270 нм у бік значень, які відповідають контрольним зразкам. У спектрі ПВ-4 при інкубації в середовищі мембран ЕР печінки інтактних та інтоксикованих щурів спостерігається гіпохромний ефект у ділянці 220-300 нм та гіперхромний — у ділянці смуг переносу заряду (СПЗ) 300-320 нм. Введення отруєним тваринам ПВ-4 призводить до часткової корекції dД_l у ділянці СПЗ (300-320 нм). Згідно з [17], СПЗ може бути зумовленою утворенням комплексу у збудженому стані, що є характерним для слабкого потенціалу іонізації донора електронів. ТХМ сприяє ще більшому зниженню потенціалу іонізації на мембрані, у той же час введення отруєним тваринам ПВ-4 частково нормалізує даний показник.

У таблиці наведені фізіко-хімічні показники мембран ЕР печінки щурів контрольної та дослідних груп. Спектральні параметри суспензій мембран ЕР печінки Д₂₃₀/Д₂₆₀ та інтенсивності їх білкової (триптофанової) флуоресценції на довжині хвилі 330 нм (f₃₃₀), які відображають процеси синтезу білка та фосфоліпідів у мембранах[8], а також співвідношення концентрацій загальні ліпіди/білок у мембранах ЕР печінки вказують на те, що у отруєних тварин зниження значень f₃₃₀ та Д₂₃₀/Д₂₆₀ може бути наслідком зменшення концентрації триптофанілів, про що свідчить також і зростання показника загальні ліпіди/білок.

Для амізону спостерігається часткова нормалізація спектральних параметрів F₃₃₀ та Д₂₃₀/Д₂₆₀, сполука ПВ-3 дещо наближує показники до контролю, у той час як ПВ-4 зазначені параметри не відновлює, а ще більш знижуює, що свідчить про зменшення концентрації триптофанілів на поверхні мембран при введенні цієї сполули і може бути наслідком комплексоутворення її з білковими молекулами, які містять дані флуорофори.

Про зміни у структурі білків у мембранах ЕР печінки дослідних груп тварин свідчать дані досліджень інтенсивності флуоресценції флуорескаміну (F_ФК) при вбудовуванні його у мембрани. Введення отруєним тваринам сполук ПВ-3 та ПВ-4 дещо підвищує значення F_ФК, яке зменшено при інтоксикації, тоді як амізон in vivo [6] достовірно нормалізує даний параметр. Таким чином, на підставі проведених експериментів можна вважати, що сполуки ПВ-3 та ПВ-4 не сприяють нормалізації концентрації е-аміногруп залишків лізину порушеної у результаті отруєння ТХМ, яка характеризує властивості поверхні мембран ЕР печінки.

При вивченні мембран ЕР за методами гасіння білкової флюоресценції дифузійним гасником акриамідом, а також вірогідності ІРПЕ (W) з донору електронів (молекул білка) на акцептор (флуоресцентний зонд пірен) спостерігалися зміни у структурі білків глибинних ділянок мембран під впливом дії ТХМ та ДС. Для мембран ЕР, виділених з печінки отруєних тварин, величина констант гасіння Штерна-Фольмера (К_SV) зростає порівняно з контролем, що вказує на розпушення структури білків при інтоксикації. Введення таким тваринам сполуки ПВ-4 достовірно нормалізує параметр КSV, у той час, як введення амізону або ПВ-3 не чинить такої дії: значення К_SV ще більш зростають відносно ТХМ. У ділянці білково-ліпідного контакту за умов отруєння спостерігається пониження вірогідності ІРПЕ (W), тобто зростає відстань між донором та акцептором електронів [2, 10], відбувається послаблення білково-ліпідного контакту. Застосування сполук ПВ-4 та ПВ-3 чинить нормалізуючу дію: величина W вірогідно зростає до значень у контролю. Як бачимо з таблиці та наших попередніх даних [6], введення отруєним тваринам амізону не призводить до корекції даного показника, що свідчить про його малу доступність до глибинних гідрофобних зон фосфоліпідного бішару мембран, у яких локалізований пірен [10], та може бути обумовлено високою полярністю молекули сполуки.

Ефективність дії лікарських засобів значною мірою визначається їх біодоступністю. Похідні ПКК є слабкими органічними лугами, а, як відомо [13], для таких сполук знайдено кореляційну залежність абсолютної біодоступності та зворотного значення константи зв'язування лугів з САЛ. Методом спектрофотометричного титрування розчинів САЛ (с=0,25 мг/мл) розчинами ДС в інтервалі концентрацій 0,5•10^-5—5•10^-4 М (tris HCl буфер, рН 7,4) були визначені величини констант зв'язування (К_ЗВ) комплексів САЛ з амізоном та сполуками ПВ-3 та ПВ-4 із залежностей 1/DД_l — 1/С_ДС (рис. 3) за методом [16]. Як бачимо, сполука ПВ-4 утворює стійкіший комплекс з САЛ, ніж, амізон: К_ЗВ становить (1,0±0,1)•10⁴ М^-1 та (3,8±0,5)•10³ М^-1, відповідно, тоді як в умовах експерименту ПВ-3 не зв'язується з САЛ. Одержані екстраполяцією значення абсолютної біодоступності (БД) відповідно [13] для сполуки ПВ-4 та амізону дорівнюють 84,1±1,2 % та 71,0±2,0 %. Таким чином, сполука ПВ-4 більш здатна до проникнення у кровообіг, як і у глибинні зони мембран ЕР печінки, ніж амізон.

Аналіз одержаних даних фізико-хімічних досліджень мембран ЕР печінки за умов інтоксикації ТХМ та введення ДС, а також результатів досліджень антиоксидантних властивостей та біодоступності останніх показав, що амізону та сполуці ПВ-4 притаманні мембраностабілізуючі властивості, при цьому ця сполука, на відміну від амізону, який є ефективним стабілізатором структури поверхні мембран, здійснює модифікацію глибинних зон мембран у ділянці білково-ліпідного контакту, що, імовірно, зумовлено його високою біодоступністю, хімічною структурою молекули.

Наявність виражених мембраностабілізуючих властивостей у сполуки ПВ-4 за умов ураження клітин печінки ТХМ підтверджується також результатами визначення показника летальності в період 24 год після введення отрути, який знижується з 40 % у отруєних тварин до 8-10 % при лікувально-профілактичному введенні сполуки ПВ-4.

Таким чином, у механізмі дії похідних ПКК домінуючими є високі значення антиоксидантної активності та біодоступності, здатність сполуки ПВ-4 до модифікації структури глибинних ділянок мембран ЕР, порушеної у результаті інтоксикації ТХМ, тоді як для амізону — здатність стабілізувати властивості поверхні мембран [5, 6].

Література
1. Ашмарин Л.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. —Л.: Изд-во ЛГУ, 1975. —78 с.
2. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биомембран. —М.: Наука, 1980. —277 с.
3. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К. Оценка антиокислительной и антирадикальной активности веществ и биологических объектов с помощью железоинициированной хемилюминесценции // Биофизика. —1992. —Т. 37, №6. —С. 1041-1047.
4. Губский Ю.И., Горюшко А.Г., Вистунова И.Е. и др. Антирадикальные и антиокислительные свойства нестероидных противовоспалительных средств — производных перидинкарбоновых кислот // Укр. біохім. журн. —1999. —Т. 71, №5. —С. 85-89.
5. Губский Ю.И., Тринус Ф.П., Бухтиарова Т.А. и др. Структурная модификация мембран мононуклеарных клеток крови крыс в условиях экспериментального артрита и фармакотерапии нестероидными противовоспалительными средствами // Журн. АМН України. —1999. —№1. —С. 110-119.
6. Губський Ю.І., Літвінова Н.В., Левицький Є.Л. та ін. Вплив препарату амізон на стан ушкоджених тетрахлорметаном хроматину та мембран клітин печінки щурів // Медична хімія —2000. —Т. 2, №3. —С. 5-10.
7. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Даниленко В.Ф. и др. Антиоксидантные и противовоспалительные свойства новых производных ариламидов пиридинкарбонових кислот // Журн. АМН України. —2000. —Т. 6, №7. —С. 115-126.
8. Губский Ю.И. Молекулярные механизмы повреждения мембран гепатоцитов при экспериментальном поражении печени: Автореф. дисс. … д-ра мед. наук. —К., 1985. —35 с.
9. Демченко А.П. Люминесценция и структура белков. —К: Наук. думка, 1988. —280 с. 10. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. —М.: Наука, 1980. —277 с.
11. Карузина М.И., Арчаков А.И. Выделение микросомальной фракции печени и характеристика ее окислительных систем // В кн.: Современные методы биохимии. —М.: Наука, 1977. —С. 49-62.
12. Курапова Т.М. Амізон —інгібітор реакції перекисного окислення у фракції мікросом печінки щурів // Одеський мед. журн. 1999. —№3(53). —С. 13-16.
13. Мусин Р.А., Пентюк А.А. Модель для экспериментальной оценки абсолютной биодоступности лекарственных веществ —слабых органических оснований // Эксперим. фармакол. и токсикол. —1993. —Т. 56, №3. —С. 64-66.
14. Патент Украины №6752 от 29.12.1994 г. "4-(N-бензил)аминокарбонил-1-метилперидиний йодид —обезболивающее средство с интерфероногенными, противовоспалительными и жаропонижающими свойствами. Тринус Ф.П., Даниленко В.Ф., Бухтиарова Т.А. и др. // "Промислова власність" —Бюлл. №8 . —С. 25-26.
15. Рао Ч.Н.Р. Электронные спектры в химии // Под ред. Я.М.Варшавского. —М.: Мир, 1964. —264 с.
16. Свердлова О.В. Электронные спектры в органической химии. —Л.: Химия, 1985. —248 с.
17. Таранова Н.П., Говорова Л.В. Микрометод определения общих липидов в лимфоцитах и другом биологическом материале // Вопр. мед. химии —1987. —№2. —С. 132-136.
18. Фролов В.М., Терьошин В.О., Бухтіарова Т.А. та ін. Ефективність нового українського препарату амізон при хронічному токсичному гепатиті та його вплив на показники пероксидації ліпідів і систем антиоксидантного захисту // Ліки. —2000. —№5. —С. 3-5.
19. Lowry O.H., Rozenbrogh N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein mesaurements with Folin fenol reagent // J. Biol. Chem. —1951. —V. 193, №2. —P. 265-275.
20. Bode J. On the reaction of fluorescamine with chromosomal proteins // Anal. Biochem. —1979. —V. 99, №2. —P. 274-280.