|
ТОКСИКОЛОГИЯ ПЕСТИЦИДОВ УДК 615.9:632.95:612.6:591.16 ВПЛИВ ІНСЕКТИЦИДУ КАРБОФУРАНУ НА ФУНКЦІЮ ГОНАД ТА ФЕРТИЛЬНІСТЬ ЩУРІВ WISTAR Н.Р. Шепельська, д.м.н., Л.П. Петрашенко, С.Д. Сапожнікова Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, Київ Одним із небажаних побічних ефектів пестицидів при дії на нецільові об'єкти є їх репродуктивна токсичність для ссавців, у тому числі для людини. Проведення досліджень, пов'язаних із попередженням шкідливого впливу хімічних засобів захисту рослин на репродуктивну функцію людини, є обов'язковою складовою частиною їх токсикологічної оцінки. Наші дослідження гонадотоксичної активності діючої речовини інсектицидного препарату адифуру — карбофурану проведені в зв'язку з тим, він був запропонований на український ринок, що потребує визначення потенційної небезпеки та оцінки ризику застосування вказанного інсектициду для репродуктивного здоров'я людини [1]. Матеріали та методи дослідження Дослідження гонадотоксичності технічного карбофурану виконані на 250 самців та самок щурів Wistar. Використані методичні підходи, відповідають вимогам [2-4]. Порошок, що містить 97 % карбофурану технічного, був наданий фірмою-виготовлювачем ("Адика", Італія) одноразово на весь курс досліджень. Документація на методи синтезу сполуки, що нами вивчалась, методи визначення наданого зразка, його склад, хімічну ідентичність, чистоту, стабільність та інші параметри, необхідні для його характеристики, належить замовнику досліджень, що несе за неї повну відповідальність. Перед початком експерименту 50 г речовини, яка нами вивчалась, були відібрані в щільно закупорену скляну посудину і зберігались в таких самих умовах (повітряно- і світлонепроникний контейнер, температура не вище 20 °С), що й основна маса данної сполуки. Ця наважка зберігається в архіві лабораторії. Схема експерименту. Піддослідні самці щурів Вістар отримували карбофуран щодня, внутрішньошлунково за допомогою зонду протягом 12-16 тижнів. Після закінчення запланованого періоду затравки (12 тижнів) частину тварин спарювали з інтактними самками. На 20-й день вагітності самки умертвлялись і в них визначалися показники, що характеризують репродуктивну функцію. Піддослідних самців затравлювали ще протягом 4-х тижнів і вони використовувалися для вивчення морфо-функціональних показників. Піддослідні самки зазнавали впливу карбофурану протягом 9 тижнів. Протягом останніх 2-х тижнів періоду затравки у самок вивчали циклічність і тривалість естрального циклу. Після закінчення періоду затравки самок спарювали з інтактними самцями. На 20-й день вагітності самок умертвляли і реєструвалися показники, що характеризують стан функції відтворення. Всі тварини, що розтинались в ході експерименту, підлягали ретельному макроскопічному дослідженню. У 10 самців із піддослідних і контрольної груп визначали коефіцієнти відносної маси сім'яників і придатків і проводили гістологічне дослідження гонад. Тварини. Щури Вістар (самці і самки) були отримані з розплідника дрібних тварин "Аідма" ЛТД. Для вивчення гонадотоксичної активності карбофурану була отримана партія тварин із 125 самців масою від 110 до 130 г і 125 самок масою від 100 до 120 г. Адаптаційний період продовжувався 20 днів. За тваринами здійснювали щоденне спостереження. При наявності ознак якоїсь патології або значного відхилення від середньої маси тварини вибраковували. Перед початком дії пестициду маса тіла самців складала 140-160 г, самок — 120-140 г. Умови утримання тварин. Тварини були розміщені в спеціально обладнаному приміщенні, доступ у яке був обмежений. Кімната була забезпечена примусовою вентиляцією (12 об'ємів за 1 год), яка виключала рециркуляцію повітря. Температуру і відносну вологість повітря реєстрували щодня, коливання температури складали від 20 до 25 °С, вологості — від 40 до 70 %. Освітлення було природнім. Тварини одержували питну воду без обмеження зі скляних пляшок місткістю 0,5 л через скляні наконечники. Протягом усього експерименту щури отримували ad libitum збалансований корм, що містить усі необхідні компоненти та складений відповідно до норм, встановлених Наказом МЗ СРСР N 1179 від 10.10.1988 року. Кількість тварин у клітці відображена в табл. 2. Затравка препаратом. Шлях введення та тривалість. Сполуку, що нами вивчалась, вводили тваринам у вигляді свіжеприготованої водяної суспензії щодня, крім суботи та неділі, внутрішньошлунково за допомогою зонду протягом 12-16 тижнів самцям і 9 тижнів самкам. 5 груп тварин, що складалися із однієї контрольної групи і 4-х піддослідних груп самців і самок, одержували сполуку в різних дозах (табл. 3). Паралельно з контрольними і піддослідними тваринами утримувалися інтактні самці і самки (по 50 шт.), призначені для спарювання. Інтактні тварини були також розподілені по групах і промаркировані. Приготування розчину та його введення. Для приготування робочих суспензій щодня готувався маточний розчин із розрахунку 10 мг речовини на 100 мл суміші. Розчин для введення максимальної дози препарату готувався щодня ex temроrе з розрахунку 10 мл вихідного маточного розчину на 100 мл робочої суспензії. Мінімальну дозу готували з розрахунку 2 мл маточного розчину на 100 мл розчину мінімальної концентрації. (відповідно до росту тварин кількість суспензії, яка готувалася, збільшували). Контрольним тваринам вводили дистильовану воду з емульгатором ОП-7 в еквівалентних кількостях. Введення здійснювали за допомогою зонду з нержавіючої сталі з оливою на кінці (модифікована голка для ін'єкцій) діаметром 1,6 мм і довжиною 60 мм, насадженого на медичний шприц об'єом 2 або 5 мл. Для корекції кількості розчину відповідно до збільшення маси тіла тварин щотижня зважували. Досліджувані показники. Всіх тварин протягом усього періоду дослідження щодня обстежували з метою реєстрації будь-яких ознак реакції на вплив вивчаємої сполуки. Піддослідних самців зважували щотижня протягом усього періоду затравки. Піддослідні самки зважувалися щотижня до періоду спарювання і на 0, 6, 13 і 20 дні роst соitum. Інтактних самців зважували 2 рази на місяць, інтактних самок — щотижня. Протягом останніх 2-х тижнів періоду затравки у піддослідних самок щодня робили вагінальні мазки з метою цитологічного дослідження тривалості усього естрального циклу, частоти та тривалості його окремих стадій. Мазки також робили з першого дня підсажування інтактних самців до піддослідних самок та піддослідних самців до інтактних самок для визначення моменту спарювання. Наприкінці запланованого періоду затравки з кожної піддослідної групи в довільному порядку відбирали по 10 самців для дослідження морфо-функціонального стану гонад (загальна кількість, кількість рухливих, нерухомих, патологічних форм сперматозоїдів, тривалість рухової активності сперміїв). 15 піддослідних самців, що залишилися в кожній групі, спарювали з інтактними самками, а піддослідних самoк — із інтактними самцями. Щоранку протягом періоду спарювання готували вагінальні мазки від кожної самки для дослідження наявних сперматозоїдів. День виявлення сперміїв у вагінальному вмісті самки приймався за 0 день вагітності. Визначали час, що минув з моменту підсажування самців до самок до моменту встановлення факту запліднення (тривалість прекоітального періоду). На 20-й день вагітності інтактних самок, спарених із піддослідними самцями, та піддослідних самок, що завагітніли від інтактних самців, умертвляли, розтинали черевну порожнину, розтинали матку, потім підраховували і реєстрували для кожної самки: Умертвіння тварин здійснювали шляхом розташування їх у камері з парами диетилового ефіру для наркозу. Для оцінки репродуктивної функції тварин визначали індекси спарювання, зачаття, вагітності і фертильності. Усі піддослідні самці і самки, що розтиналися в ході експерименту, піддавалися макроскопічному обстеженню. Сім'яники і придатки сім'яників від 10 піддослідних і контрольних самців виділяли і зважували. Проводили гістологічне дослідження сім'яників. Статистичну значимість міжгруппових розбіжностей оцінювали за критерієм t Стьюдента. Результати та їх обговорення Самці. Карбофуран технічний у жодній із випробуваних доз не впливав на загальний стан піддослідних самців та не викликав загибелі тварин. Починаючи з 8 тижня періоду впливу, у тварин, які зазнали дії меншої дози карбофурану, намітилося відставання маси тіла, що спостерігалося до періоду спарювання (табл. 4). Але наприкінці 16 тижня періоду затравки у самців вказаної групи, призначених для вивчення сперматологічних і морфо-функціональних показників стану сім'яників, маса тіла наблизилася до такої контрольних тварин. З огляду на це, а також маси тіла тварин, що одержували максимальну дозу, можна припустити, що зміна динаміки маси тіла не пов'язана з впливом карбофурану. Не виявлено негативного впливу карбофурану на такі показники, як загальна кількість сперматозоїдів та відносна кількість (%) рухливих сперміїв (табл. 5). Відсоток патологічних форм сперматозоїдів у піддослідних тварин 1 групи вірогідно не відрізнявся від контролю. В 2 групі відносна кількість патологічно змінених форм сперматозоїдів була вірогідно менша, ніж у контролі. Більшість інтактних самок булa покритa піддослідними самцями в першу ж стадію еструсу. Водночас значення величини прекоітального інтервалу в контрольній групі значно перевищувало таку в піддослідних групах Запліднююча здатність самців та їх плодовитість, які визначали по індексах зачаття і фертильності інтактних самок, виявилися дещо нижчими в 1 групі (табл. 6). Аналіз результатів досліджень репродуктивної функції інтактних самок дозволив прийти до висновку, що карбофуран не впливає на репродуктивну здатність спарених із ними піддослідних самців (табл. 6). Кількість живих плодів у піддослідних групах, число загиблих до і після імплантації зародків, а також відсоток доімплантаційної загибелі вірогідно не відрізнялися від рівня контролю. Проте, не можна не відзначити більш низький біотичний потенціал інтактних самок, що спарювалися з піддослідними самцями, що одержували карбофуран у меншій дозі. Кількість жовтих тіл у самок цієї групи вірогідно відрізняється від контролю. Вказаний факт, зрозуміло, не є ознакою токсичної дії препарату, який тестувався, проте, зниження кількості жовтих тіл спричинило деяке зниження кількості живих плодів (хоча і статистично недостовірне). В результаті цього показники відносної постімплантаційної летальності в цій групі вірогідно перевищили таку в контролі. Маса тіла плодів змінювалася в межах фізіологічних коливань та в піддослідних групах вірогідно не відрізнялася від контролю. Макроскопічне обстеження сім'яників і придатків у тварин, що зазнали впливу карбофурану, не виявило видимої патології цих органів. Не спостерігалося відхилень у величині абсолютної і відносної маси tеstеs та придатків сім'яників. Гістологична оцінка сім'яників контрольних самців і тварин, що одержували карбофуран, не виявила змін, що могли б бути пов'язані із впливом сполуки, що досліджувалась. Самки. Карбофуран не впливав на загальний стан і масу тіла самок, що одержували препарат. Загибелі тварин не спостерігалося. Протягом 2-х тижневого періоду спостереження за естральним циклом у самок піддослідних груп не визначалося значних відхилень у частоті і тривалості естрального циклу і кожної його стадії (табл. 7). Більшість піддослідних самок спарилося з інтактними самцями в першу ж стадію еструса. Величина тривалості прекоітального інтервалу в піддослідних групах знаходилася в межах фізіологічних коливань і вірогідно не відрізнялася від контролю (табл. 7). Величини індексів спарювання і фертильності в усіх групах тварин, що одержували карбофуран, не відрізнялися від контролю. Здатність до зачаття в самок піддослідних груп практично була однаковою з такою у контрольних самок. Індекс вагітності також не змінювався (табл. 8). У 1 групі піддослідних самок спостерігалися достовірні розбіжності кількості жовтих тіл у порівнянні з контролем, що можна пояснити як деяке зниження біотичного потенціалу. У 2 піддослідній групі не спостерігалося достовірних розбіжностей показників плодовитості та здатності самок до зачаття (табл. 8). У піддослідних групах самок зареєстрована тенденція до зниження кількості живих плодів у посліді, що проте не досягає рівня вірогідності (табл. 7). Середня маса тіла плодів у піддослідних групах статистично не відрізняється від контролю (табл. 8). При макроскопічному обстеженні піддослідних вагітних самок, що були умертвлені наприкінці експерименту, ніяких змін, пов'язаних із впливом препарату, не виявлено. У самок, що не завагітніли, при макроскопічному обстеженні також не виявлено змін внутрішніх органів. Таким чином, в групах тварин, що одержували карбофуран у дозі 0,1 мг/кг щодня внутрішньошлунково протягом 12-16 (самці) і 9 тижнів (самки), спостерігається деяке зниження фертильності самців та біотичного потенціалу самок. Проте, не можна не відзначити, що кількість жовтих тіл у піддослідних самок 1 групи, хоча і відрізняється статистично вірогідно від контролю, знаходиться на рівні величини цього показника у інтактних самок 2 групи. Цей факт може свідчити про індивідуальну варіабельність плодовитості даної субпопуляції щурів, яка відповідає фізіологічним коливанням показника. Зниження фертильності самців реєструється на фоні незвичайно високої величини його в контролі (100 %), що також можна пояснити, як фізіологічні коливання. В умовах проведеного експерименту недіючою дозою по гонадотоксичному ефекту для самок і самців щурів Wistar (NOAEL) є доза 0,1 мг/кг маси тіла. Отримані результати дозволили віднести карбофуран до 2-го класу небезпеки по репродуктивній токсичності [5] і були лімітуючими при идентифікації безпечних рівнів впливу та оцінці ризику його застосування для здоров'я людини. Література |