МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 577.17:577.352.38 СОСТОЯНИЕ ГЛУТАТИОНОВОЙ ДИСУЛЬФИДРЕДУКТАЗНОЙ СИСТЕМЫ У КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭМБИХИНА Л.В. Бойцова, к.б.н. Институт фармакологии та токсикологии АМН Украины Эмбихин (метил-ди(2-хлорэтил)-амина) гидрохлорид) — первый препарат из группы хлорэтиламинов, разработанный в конце 50-х годов. Препарат до настоящего времени широко используется в клиниках Германии, США и некоторых других стран для лечения лимфогранулематоза, хронического миелолейкоза, злокачественных неходжкинских лимфом, мелкоклеточного рака легкого, эритремии, грибовидного микоза [1]. Эмбихин вошел в одну из лучших современных схем комбинированной химиотерапии лимфогранулематоза — схемы МОРР: эмбихин, винкристин, натулан и преднизолон [2]. В середине 90-х годов в Институте фармакологии и токсикологии АМН Украины был осуществлен ресинтез этого препарата и проводятся работы по изучению его токсикологических свойств и специфической активности. Ранее нами были опубликованы работы по изучению механизмов влияния эмбихина на состояние тиоловой системы [3,4]. С целью выяснения роли глутатионовой дисульфидредуктазной системы в механизме цитотоксического действия эмбихина мы исследовали содержание глутатиона, активность глутатионредуктазы и тиолтрансферазы в различных органах крыс под воздействием эмбихина в дозе 1/2 ЛД50. Материалы и методы Опыты проведены на 60 белых крысах-самках с массой тела 200-240 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Животным однократно вводили эмбихин в дозе 1/2 ЛД50 (0,825 мг/кг, подкожно). В каждом варианте эксперимента использовали по 6 животных. Рабочий раствор препарата готовили на физиологическом растворе непосредственно перед экспериментом из кристалического метил-ди(2-хлорэтил)амина гидрохлорида, синтезированного в Отделе технологии синтеза и анализа лекарственных средств ИФТ АМН Украины. Через 15, 30 мин, 1, 3, 6 ч и 1, 3 суток животных декапитировали. Забор печени, почек и селезенки для дальнейших биохимических исследований проводили на холоду. Печень отмывали от эритроцитов холодным физиологическим раствором. Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона проводили в депротеинизированном цитозоле флюорометрическим методом [5] c регистрацией показателей на флуориметре Hitachi MPS-4 (Япония). В качестве флюоресцентного реагента использовали о-фталевый альдегид ("Sigma", США). Активность ферментов глутатионовой дисульфидредуктазной системы определяли в цитозоле. Цитозоль выделяли методом дифференциального центрифугирования на центрифуге MSE-65 (Англия) с угловым ротором [6]. Активность глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2) оценивали по потреблению НАДФН ("Sigma") [7], а тиолтрансферазы (ТТ, КФ 2.1.1.9) [8] — по скорости окисления НАДФН в сопряженной глутатионредуктазной системе. Содержание белка в цитозоле определяли по методу[9]. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Shimadzu MPS-500 (Япония). Количество восстановленного глутатиона и его дисульфида выражали в мкмолях на 1 г ткани, удельную активность ГР и ТТ — в нмоль/мин на мг белка в цитозоле. Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение Результаты изучения влияния эмбихина в дозе 1/2 ЛД50 на содержание восстановленного глутатиона и его дисульфида в различных органах крыс представлены на рис. 1. Согласно полученным данным, эмбихин вызывает на раннем этапе интоксикации (15, 30 мин, 1 ч после введения) снижение содержания восстановленного глутатиона во всех исследуемых органах по сравнению с контролем (интактные животные), что свидетельствует как о ферментативном, так и прямом взаимодействии алкилирующего агента с SH-группами глутатиона. Метаболизм эмбихина в организме экспериментальных животных связан с активацией ферментов II фазы биотрансформации ксенобиотиков, в частности, с увеличением активности цитозольных глутатион-S-трансфераз и образованием соответствующих конъюгатов глутатиона с параллельным уменьшением концентрации восстановленного глутатиона [4]. Уменьшение пула восстановленного глутатиона сменяется его увеличением в печени через 3 ч, а в почках спустя 1 сут повышением концентрации трипептида на 32,0 % (Р<0,05) и 15,0 % (Р<0,05), соответственно, как результат процессов биохимической адаптации клетки к токсическому воздействию, характерному для алкилирующих агентов различного химического строения [10]. В ткани селезенки этот эффект не был зарегистрирован, хотя возможность повышения концентрации восстановленного глутатиона и не исключается во временной отрезок, который не вошел в динамику исследований. Дальнейшее снижение уровня восстановленного глутатиона в исследуемых органах, главным образом, является отражением защитной реакции глутатионовой антипероксидной системы тканей организма на активацию процессов ПОЛ [11]. Динамика накопления дисульфида глутатиона после введения противоопухолевого препарата свидетельствует об усилении процессов окисления глутатиона при прямом или ферментативном обезвреживании первичных и вторичных продуктов ПОЛ, что в значительной степени защищает клетку от цитотоксических эффектов цитостатика (рис. 1). На рис. 2 представлены результаты изучения ключевых ферментов глутатионовой дисульфидредуктазной системы — ГР и ТТ. Повышение в тканях дисульфида глутатиона сопровождается активацией ГР и направлено на восстановление глутатиона — основного компонента редокс-буфера клетки, препятствующего ковалентной модификации белков [12 ]. Цитотоксические эффекты эмбихина проявляются в угнетении тиол-дисульфидного обмена в ткани печени и почек, где отмечено стойкое снижение активности ТТ по сравнению с интактными животными. Учитывая, что субстратами этого фермента являются цистин, смешаный дисульфид КоА и глутатиона, дисульфидные гормоны, ряд ферментов (РНКаза, пепсин, трипсин, химотрипсин, лизоцим) и другие внеклеточные белки, нарушения тиол-дисульфидного обмена могут привести к изменению многих важных функций белков и низкомолекулярных тиолов. В митотически активной ткани селезенки, высокочувствительной к действию алкилирующих веществ, зарегистрировано стойкое повышение активности ТТ в первые минуты и часы после введения эмбихина, направленное на восстановление SH-групп белков и смешаных дисульфидов, которое через 6 ч меняется снижением активности фермента на 68,8 % по отношению к контролю. Таким образом, цитотоксические эффекты эмбихина на уровне глутатионовой дисульфидредуктазной системы проявляются уменьшением пула восстановленного глутатиона с появлением, в зависимости от органа и времени после введения препарата, компенсаторного повышения концентрации трипептида. Увеличение содержания дисульфида глутатиона во всех исследованных органах зарегистрировано параллельно с повышением глутатионредуктазной активности, направленной на поддержание концентрации восстановленного глутатиона. Интоксикация сопровождается стойким угнетением активности ТТ в печени и почках напротяжении всего периода исследований, а в селезенке — спустя 6 ч после введения противоопухолевого препарата. Литература |