ЛЕЧЕНИЕ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 636.52 /. 58.08772 : 612.017.4
ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТНОЙ КОМПОЗИЦИИ НА АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА КУР, ПОРАЖЕННЫХ И.А. Ионов, д.б.н., С.О. Шаповалов, А.Н. Котик д.вет.н.
Н.Е. Узленкова, к.б.н.
А.С. Григорьева, д.х.н., Н.Ф. Конахович, к.х.н.
В настоящее время известно более 300 микроскопических грибов — продуцентов микотоксинов. Продуцентами трихотеценовых микотоксинов являются многие виды грибов рода Fusarium. К ним относится Т-2-токсин (4-бета, 15диацетокси-3-альфа.гидрокси-8-альфа-[3-метил-бутирилокси]-12,13-эпокситрихотец-9-ен), который наиболее часто обнаруживается в кормах птиц и отличается высокой степенью токсичности. Клиническая картина Т-2 токсикоза у птиц проявляется замедлением роста, снижением продуктивных качеств и воспроизводительной функции. При этом снижение яйценоскости кур пропорционально концентрации токсина в рационе [1]. Низкие концентрации микотоксинов приводят к нарушениям обмена веществ и снижению резистентности организма к инфекционным болезням [2]. При затяжном течении отмечается истощение и летальный исход [3]. В патогенезе микотоксикозов определяющую роль играет активация процессов перекисного окисления липидов [4,5]. Для обеспечения эффективной клеточной защиты необходимо полноценное функционирование антиоксидантной системы цитоплазмы и мембран клеток. Важнейшие антиоксидантные ферменты содержат в активном центре биометаллы-микроэлементы, дефицит которых может снижать антиоксидантный потенциал организма в целом. Микроэлементы, наряду с некоторыми витаминами [1,5,6], относятся к алиментарным факторам, способным снижать мембраноповреждающее действие токсинов [7, 8]. Эссенциальная роль биометаллов в функционировании антиоксидантных ферментов, с которой связана их способность повышать неспецифическую устойчивость организма, обусловливает целесообразность применения микроэлементов в условиях Т-2 токсикоза. Важным фактором при этом является влияние на способность организма к усвоению микроэлементов сбалансированности состава и формы содержащих их препаратов. В настоящей работе изучена эффективность при Т-2 токсикозе оригинальной микроэлементной композиции "Биотам". В этой композиции 6 d-металлов (Fe, Cu, Mn, Zn, Co, Cr) находятся в форме комплексных соединений с аминокарбоновой кислотой, которые сочетаются с соединениями Мо6+, V5+ и Se4+ в виде солей кислородных кислот. Ранее в эксперименте в условиях воздействия ионизирующей радиации [9] установлено гемостимулирующее и мембранотропное действие "Биотама". Координационно-химическое состояние основных микроэлементов обусловливает повышение их биодоступности [10], что позволяет априорно значительно снизить дозы Биотама в рационе птиц в сравнении со стандартными добавками солей металлов. Целью настоящей работы было изучение эффективности применения препарата "Биотам" при Т-2 токсикозе и его влияния на структурно-функциональные характеристики клеточных мембран. Материалы и методы исследования Эксперимент проведен на курах-несушках породы род-айланд возраста 290 дней. Были сформированы 5 групп по 50 голов птиц-аналогов: 1 группа — контроль (рацион с добавками стандартного премикса, содержащего микроэлементы в виде сульфатов); 2-я группа — рацион с добавками стандартного премикса + Т-2 токсин (6 мг/кг корма/день), 3-я группа — рацион без стандартного премикса + "Биотам" (20 мг/кг массы тела/день); 4-я группа — рацион без стандартного премикса + "Биотам" (20 мг/кг массы тела/день) + Т-2 токсин (6 мг/кг корма/день) и 5-я группа — рацион без стандартного премикса + "Биотам" (100 мг/кг массы тела/день) + Т-2 токсин (6 мг/кг корма/день). Токсин вводили в рацион в кристаллическом виде в концентрации, соответствующей его типичному содержанию в комбикормах. Введение Т-2 токсина и композиции "Биотам" проводили на протяжении 21 дня. При этом суточные дозы вводимых микроэлементов для экспериментальных птиц 3-5-й групп были от 4 (Fe) до 100 (Mn) раз меньше, чем в 1-й и 2-й группах. На 7, 14 и 21 сут эксперимента проводили отбор крови с подкрыльцовой вены. Кровь стабилизировали 1 % раствором гепарина и сохраняли при температуре +40°С. По окончании опыта птицу забивали, извлекали печень и мозг. Определяли содержание малонового диальдегида (МДА) [11], содержание диеновых конъюгатов в плазме крови [12], активность каталазы (К) [13], супероксиддисмутазы (СОД) [14], глутатионтрансферазы (ГТ) [15], глутатионредуктазы (ГР) [17] и глутатионпероксидазы (ГПО) [16], а также содержание восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона в крови [19], содержание восстановленного глутатиона в печени и мозге [18], содержание витамина А и каротиноидов [20]; концентрацию гемоглобина (Hb), количество эритроцитов, гематокритное число (Ht). Содержание гемоглобина в одном эритроците определяли на гематологическом анализаторе "Sysmex". Устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу изучали на автоматической установке Kinetic Shapemeter SH-01 по времени гемолиза эритроцитов и скорости проникновения гемолитика через мембрану при двух различных концентрациях соляной кислоты с получением графического изображения процесса гемолиза на IBM- PC. Электромеханическую стабильность эритроцитарных мембран изучали путем измерения силы тока и напряжения электрического пробоя (I ma, U mv), отношения проводимости (ОП) и удельного сопротивления эритроцитов до и после электрического пробоя мембран, возникающего под воздействием внешнего электрического поля, а также исследовали морфологические параметры эритроцитов: величину среднего объема и диаметра, гистограммы их распределения, которые определяли на электроцитоанализаторе ЭЦА-02. Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стъюдента. Результаты и их обсуждение В результате проведенных исследований установлено, что Т-2 токсин является активатором свободнорадикальных процессов, в результате которых происходит повреждение клеточных мембран, особенно эритроцитов. Так, на 21 сут после введения Т-2 токсина достоверно повышается содержание МДА в гепатоцитах (на 37-52 %), нейроцитах (на 16-23 %), эритроцитах (на 37-96 %) как при свободном ПОЛ, так и при стимулировании этого процесса ионами Fe2+ или аскорбатом (табл. 1 и 2). Применение композиции "Биотам" способствует снижению спровоцированной Т-2 токсином активности протекания процессов ПОЛ в организме птиц. На фоне совместного введения Т-2 токсина и препарата "Биотам" в обеих использованных дозах (группы 4 и 5) содержание МДА в гепатоцитах, нейроцитах и эритроцитах на 21 сутки достоверно снижено по сравнению с таковым при воздействии токсина (группа 2) и практически соответствует таковому в интактном контроле. При этом введение препарата "Биотам" (3 группа) на 21 сут обусловливало снижение содержания МДА в гепатоцитах до 20 % и оставалось на уровне контроля в нейроцитах и эритроцитах (с тенденцией к небольшому повышению свободного ПОЛ в эритроцитах). Таким образом, "Биотам" снижал накопление МДА во всех исследованных тканях, проявляя тем самым антиоксидантный эффект. Антиоксидантным проявлениям соответствуют и результаты изучения динамики влияния "Биотама" на содержание МДА в эритроцитах при Т-2 токсикозе (табл. 2). Эти данные тем более показательны, поскольку при патологических процессах модификация эритроцитарных мембран отражаeт изменения, происходящие в плазматических мембранах других клеток [21]. Уже на 7-е сут наблюдения Т-2 токсикоз сопровождается значительным повышением содержания МДА в эритроцитах, которое наиболее выражено к 21 сут (до 96 %). Относительное снижение интенсивности процессов ПОЛ на 14 сутки (на 14-22 % выше контроля) может быть связано с активацией процесса эритропоэза как адаптационной реакции организма на снижение количества эритроцитов вследствие гемолиза. В результате этого появляются молодые, более устойчивые к влиянию гемолитика клетки, и повреждающее действие Т-2 токсина на мембрану эритроцитов менее заметно. При хроническом воздействии Т-2 токсина процессы ПОЛ усиливаются и вызывают деструктивные изменения мембран. Подтверждением этому служит не только значительное увеличение содержания МДА в эритроцитах к 21 сут наблюдения, но и повышенное содержание диеновых конъюгатов в плазме крови: (17,58±1,07) мкг/мл (р<0,01) в группе, получавшей Т-2 токсин, по сравнению с (9,35±1,18) мкг/мл в контроле. Следовательно, Т-2 токсин приводит к возникновению свободнорадикальной патологии с накоплением как начальных, так и промежуточных продуктов липопероксидации. На фоне введения препарата "Биотам" при Т-2 токсикозе отмечается положительная динамика снижения уровня ПОЛ: на 7 сут — до 25 %, на 14 сут — до 30 %, на 21 сут — до 50 % (табл. 2). Наблюдаемое повышение антиоксидантного статуса обусловлено эффектом устойчивого влияния вводимых микроэлементов на ферментный фон организма. При Т-2 токсикозе повышенная активность свободнорадикальных процессов, обусловливающая накопление в крови супероксидных анионов, пероксидных радикалов, гидроперекисей и т.д., сопровождается активацией ряда антиоксидантных ферментов (табл. 3). Активность ГПО увеличивается на протяжении всего опыта и в сравнении с контролем на 21 сут повышается в 2 раза. Известно, что активность ГПО в клетках детерминируется интенсивностью образования восстановленного глутатиона в глутатионредуктазной реакции. Повышение активности этого фермента в условиях активизации липопероксидации, вызванной Т-2 токсином, является важным фактором предотвращения нарушения целостности мембран эритроцитов. Рост активности ГР (максимальный на 7 сут) может быть связан с поддержанием восстановленного глутатиона в эритроцитах, поскольку ГР катализирует реакцию восстановления сульфгидрильных групп глутатиона. Низкомолекулярным тиолам и, прежде всего, глутатиону, принадлежит важная роль в поддержании резистентности клеток к действию повреждающих факторов [22]. Было установлено, что у крыс введение Т-2 токсина, стимулировавшее ПОЛ, было сопряжено со снижением пула восстановленного глутатиона и повышением активности глутатионтрансферазы [6]. Эта закономерность подтверждается у птиц: Т-2 токсин значительно снижает концентрацию восстановленного глутатиона во всех тканях (р<0,01) и повышает содержание его окисленной формы (табл. 4). Так, концентрация общего глутатиона в крови снижалась на 24 %, восстановленного на 41 %; в то же время содержание окисленного глутатиона повышалось почти в 2 раза. Накопление перекисей в результате ПОЛ сопровождалось активацией глутатионпероксидазы, что приводит к интенсивному использованию восстановленного глутатиона и образованию окисленного глутатиона. Активизация ГПО и ГР является определяющим фактором, поддерживающим восстановительный потенциал глутатиона. Введение препарата "Биотам" способствует повышению интактного пула восстановленного глутатиона на 94 %, а на фоне Т-2 токсикоза поддерживает его на уровне контроля. Протекторный эффект "Биотама" наиболее выражен при введении большей дозы препарата (5 группа). Известно, что ГТ осуществляет детоксикацию многих ксенобиоттиков [23, 24], а также Т-2 токсина [6] путем их конъюгации с глутатионом. В наших исследованиях при Т-2 токсикозе отмечено повышение активности ГТ, максимальное на 7 сут опыта (табл. 3). Увеличение активности ГТ при одновременном уменьшение содержания восстановленного глутатиона свидетельствует об образовании соответствующих конъюгатов на ранних сроках поступления токсина в организм. Снижение содержания восстановленного глутатиона может быть связано с образованием тиоловых конъюгатов с формами Т-2 токсина, а также, вероятно, с прямым взаимодействием нуклеофильной молекулы восстановленного глутатиона с Т-2 токсином. Усиление активности ГР объясняется также тем, что она играет стабилизирующую роль в поддержании клеточного пула восстановленного глутатиона, который необратимо расходуется в процесс конъюгации с Т-2 токсином и свободными радикалами, образовавшихся в результате липопероксидации. Введение "Биотама" в группах 4 и 5 обусловливало значительное снижение активности ГТ в сравнении с влиянием Т-2 токсина (табл.3). При этом отмечены повышение восстановленной формы глутатиона во всех изучаемых тканях и нормализация активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах. Такой комплексный характер влияния препарата вполне закономерен, так как повышение в клетках восстановленной формы глутатиона уменьшает потребность его регенерации из дисульфидной формы и приводит к снижению до физиологического уровня активности ГР и ГТ. При активизации процессов ПОЛ, вызванных Т-2 токсином, в эритроцитах наблюдается компенсаторное повышение СОД и метаболически связанной с ней каталазы (табл. 3). Введение препарата "Биотам", снижающего аномальное ПОЛ на фоне Т-2 токсикоза, приводит и к нормализации активности этих ферментов. Исследование неферментативного звена антиоксидантной системы показало, что при Т-2 токсикозе происходит значительное снижение концентрации ретинола в печени (720,0±41,35 мкг/г; в контроле 912,0±48,92 мкг/г). Это соответствует ранее полученным данным о том, что Т-2 токсин, а также другие микотоксины существенно понижают уровень витамина А в организме птицы [25]. "Биотам" не только устраняет негативное влияние Т-2 токсина на содержание витамина А в печени (4 и 5 группы), но и обеспечивает повышение содержания витамина А в печени в сравнении с интактным контролем (1020,0±87,4 мкг/г и 990,0±76,48 мкг/г, соответственно). Проведенные биофизические исследования позволили получить объективную информацию о состоянии и конформационных изменениях в мембранах эритроцитов и установить сдвиги популяций клеток крови при Т-2 токсикозе. В условиях Т-2-токсикоза происходит нарушение однородности популяции эритроцитов, циркулирующих в кровеносном русле, на что указывает изменение среднего объема и диаметра эритроцитов (табл. 5). Несмотря на колебания средних значений размеров эритроцитов, соответствующие физиологическому анизоцитозу, интегральные показатели, характеризующие относительное распределение клеток по объему и диаметру, свидетельствует о том, что Т-2 токсин приводит к развитию на 21-е сут явления микроцитоза, т.е. нарастанию субпопуляции эритроцитов с малыми размерами. Нарастающий микроцитоз может являться признаком токсического поражения организма и соответствовать как мембранопатиям, так и гематологическим расстройствам, подтверждаемым данными клинического анализа крови. У кур, получавших токсин, в крови уменьшались содержание гемоглобина и гематокрит с тенденцией к снижению средней насыщаемости эритроцита железом. При введении "Биотама" эти проявления токсикоза полностью нивелировались. Более того,сам "Биотам" (группа 3) способствовал укреплению однородности и функциональной полноценности популяции клеток красного ростка кроветворения. Свойства клеточной мембраны эритроцитов в значительной степени определяют электрические характеристики клетки. Изменение диаметра и объема клеток, нарушение микровязкости и интегральной целостности их клеточных мембран, вызванное активацией процессов перекисного окисления липидов, существенно влияет на величину электрического пробоя и электрической емкости мембран. При развитии Т-2 токсикоза происходят сложные нарушения физико-химических свойств мембран эритроцитов с изменением их устойчивости и проницаемости (табл. 6). Уже в ранние сроки после введения Т-2 токсина достоверно повышаются величины тока и напряжения электрического пробоя, которые остаются высокими и на 21-е сут. Одновременно снижаются показатели удельного сопротивления относительной проводимости цитоплазмы клеток. Нарушениям проницаемости мембран в условиях токсического поражения соответствуют и показатели кислотного гемолиза эритроцитов (табл. 7). На 7 сут интоксикации отмечается снижение времени гемолиза даже при низких концентрациях (0,0028 N) соляной кислоты при увеличении скорости проникновения гемолитика через мембрану. Эти данные говорят о том, что Т-2 токсин вызывает снижение устойчивости мембран "молодых", наиболее "прочных" в благоприятных физиологических условиях эритроцитов. В более продолжительные сроки наблюдения происходила нормализация показателей кислотного гемолиза. "Биотам" вызвал достоверное увеличение прочности эритроцитарных мембран: при низкой концентрации соляной кислоты время гемолиза увеличивалось при снижении его скорости. При повышении концентрации гемолитика эти показатели были на уровне контрольных значений. Тот же эффект сохранялся в условиях совместного применения Т-2 токсина и "Биотама". Выявленные на модели мембран эритроцитов изменения их структурно-функциональных свойств и электромеханических характеристик является отражением общих закономерностей мембранных нарушений, лежащих в основе молекулярных механизмов патологических изменений в тканях в условиях Т-2-токсикоза [26]. При воздействии Т-2 токсина происходит мобилизация ферментативной антиоксидантной защиты, что препятствует повреждению цитомембран. "Биотам" стабилизирует и укрепляет ферментный фон организма благодаря ферментимитирующей активности и прямому антиоксидантному действию его микроэлементных компонентов [10]. Выводы 1. Т-2 токсин является мощным стимулятором процессов перекисного окисления липидов, являющимся одним из механизмов нарушения целостности клеточных мембран. 2. Т-2 токсин вызывает вторичную свободнорадикальную форму патологии, что выражается в снижении содержания эндогенных антиоксидантов и существенном увеличении активности ряда антиоксидантных ферментов. 3. Одним из путей метаболической инактивации Т-2 токсина в организме является стимуляция глутатионовой системы. 4. Т-2 токсин способствует развитию мембранопатий и гематологических расстройств. 5. Благодаря ферментимитирующей активности и прямому антиоксидантному действию микроэлементных компонентов, препарат "Биотам" является эффективным антитоксическим средством при Т-2 токсикозе. Література |