ЛЕЧЕНИЕ ИНТОКСИКАЦИЙ

УДК 636.52 /. 58.08772 : 612.017.4

ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТНОЙ КОМПОЗИЦИИ НА АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА КУР, ПОРАЖЕННЫХ Т-2 ТОКСИНОМ

И.А. Ионов, д.б.н., С.О. Шаповалов, А.Н. Котик д.вет.н.
Институт птицеводства ААН Украины, г. Харьков

Н.Е. Узленкова, к.б.н.
Институт медицинской радиологии АМН Украины, г. Харьков

А.С. Григорьева, д.х.н., Н.Ф. Конахович, к.х.н.
Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев

В настоящее время известно более 300 микроскопических грибов — продуцентов микотоксинов. Продуцентами трихотеценовых микотоксинов являются многие виды грибов рода Fusarium. К ним относится Т-2-токсин (4-бета, 15диацетокси-3-альфа.гидрокси-8-альфа-[3-метил-бутирилокси]-12,13-эпокситрихотец-9-ен), который наиболее часто обнаруживается в кормах птиц и отличается высокой степенью токсичности.

Клиническая картина Т-2 токсикоза у птиц проявляется замедлением роста, снижением продуктивных качеств и воспроизводительной функции. При этом снижение яйценоскости кур пропорционально концентрации токсина в рационе [1]. Низкие концентрации микотоксинов приводят к нарушениям обмена веществ и снижению резистентности организма к инфекционным болезням [2]. При затяжном течении отмечается истощение и летальный исход [3].

В патогенезе микотоксикозов определяющую роль играет активация процессов перекисного окисления липидов [4,5]. Для обеспечения эффективной клеточной защиты необходимо полноценное функционирование антиоксидантной системы цитоплазмы и мембран клеток. Важнейшие антиоксидантные ферменты содержат в активном центре биометаллы-микроэлементы, дефицит которых может снижать антиоксидантный потенциал организма в целом. Микроэлементы, наряду с некоторыми витаминами [1,5,6], относятся к алиментарным факторам, способным снижать мембраноповреждающее действие токсинов [7, 8].

Эссенциальная роль биометаллов в функционировании антиоксидантных ферментов, с которой связана их способность повышать неспецифическую устойчивость организма, обусловливает целесообразность применения микроэлементов в условиях Т-2 токсикоза. Важным фактором при этом является влияние на способность организма к усвоению микроэлементов сбалансированности состава и формы содержащих их препаратов.

В настоящей работе изучена эффективность при Т-2 токсикозе оригинальной микроэлементной композиции "Биотам". В этой композиции 6 d-металлов (Fe, Cu, Mn, Zn, Co, Cr) находятся в форме комплексных соединений с аминокарбоновой кислотой, которые сочетаются с соединениями Мо6+, V5+ и Se4+ в виде солей кислородных кислот. Ранее в эксперименте в условиях воздействия ионизирующей радиации [9] установлено гемостимулирующее и мембранотропное действие "Биотама".

Координационно-химическое состояние основных микроэлементов обусловливает повышение их биодоступности [10], что позволяет априорно значительно снизить дозы Биотама в рационе птиц в сравнении со стандартными добавками солей металлов.

Целью настоящей работы было изучение эффективности применения препарата "Биотам" при Т-2 токсикозе и его влияния на структурно-функциональные характеристики клеточных мембран.

Материалы и методы исследования

Эксперимент проведен на курах-несушках породы род-айланд возраста 290 дней. Были сформированы 5 групп по 50 голов птиц-аналогов: 1 группа — контроль (рацион с добавками стандартного премикса, содержащего микроэлементы в виде сульфатов); 2-я группа — рацион с добавками стандартного премикса + Т-2 токсин (6 мг/кг корма/день), 3-я группа — рацион без стандартного премикса + "Биотам" (20 мг/кг массы тела/день); 4-я группа — рацион без стандартного премикса + "Биотам" (20 мг/кг массы тела/день) + Т-2 токсин (6 мг/кг корма/день) и 5-я группа — рацион без стандартного премикса + "Биотам" (100 мг/кг массы тела/день) + Т-2 токсин (6 мг/кг корма/день). Токсин вводили в рацион в кристаллическом виде в концентрации, соответствующей его типичному содержанию в комбикормах. Введение Т-2 токсина и композиции "Биотам" проводили на протяжении 21 дня. При этом суточные дозы вводимых микроэлементов для экспериментальных птиц 3-5-й групп были от 4 (Fe) до 100 (Mn) раз меньше, чем в 1-й и 2-й группах.

На 7, 14 и 21 сут эксперимента проводили отбор крови с подкрыльцовой вены. Кровь стабилизировали 1 % раствором гепарина и сохраняли при температуре +40°С. По окончании опыта птицу забивали, извлекали печень и мозг. Определяли содержание малонового диальдегида (МДА) [11], содержание диеновых конъюгатов в плазме крови [12], активность каталазы (К) [13], супероксиддисмутазы (СОД) [14], глутатионтрансферазы (ГТ) [15], глутатионредуктазы (ГР) [17] и глутатионпероксидазы (ГПО) [16], а также содержание восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона в крови [19], содержание восстановленного глутатиона в печени и мозге [18], содержание витамина А и каротиноидов [20]; концентрацию гемоглобина (Hb), количество эритроцитов, гематокритное число (Ht).

Содержание гемоглобина в одном эритроците определяли на гематологическом анализаторе "Sysmex". Устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу изучали на автоматической установке Kinetic Shapemeter SH-01 по времени гемолиза эритроцитов и скорости проникновения гемолитика через мембрану при двух различных концентрациях соляной кислоты с получением графического изображения процесса гемолиза на IBM- PC. Электромеханическую стабильность эритроцитарных мембран изучали путем измерения силы тока и напряжения электрического пробоя (I ma, U mv), отношения проводимости (ОП) и удельного сопротивления эритроцитов до и после электрического пробоя мембран, возникающего под воздействием внешнего электрического поля, а также исследовали морфологические параметры эритроцитов: величину среднего объема и диаметра, гистограммы их распределения, которые определяли на электроцитоанализаторе ЭЦА-02.

Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стъюдента.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований установлено, что Т-2 токсин является активатором свободнорадикальных процессов, в результате которых происходит повреждение клеточных мембран, особенно эритроцитов. Так, на 21 сут после введения Т-2 токсина достоверно повышается содержание МДА в гепатоцитах (на 37-52 %), нейроцитах (на 16-23 %), эритроцитах (на 37-96 %) как при свободном ПОЛ, так и при стимулировании этого процесса ионами Fe2+ или аскорбатом (табл. 1 и 2).

Применение композиции "Биотам" способствует снижению спровоцированной Т-2 токсином активности протекания процессов ПОЛ в организме птиц. На фоне совместного введения Т-2 токсина и препарата "Биотам" в обеих использованных дозах (группы 4 и 5) содержание МДА в гепатоцитах, нейроцитах и эритроцитах на 21 сутки достоверно снижено по сравнению с таковым при воздействии токсина (группа 2) и практически соответствует таковому в интактном контроле. При этом введение препарата "Биотам" (3 группа) на 21 сут обусловливало снижение содержания МДА в гепатоцитах до 20 % и оставалось на уровне контроля в нейроцитах и эритроцитах (с тенденцией к небольшому повышению свободного ПОЛ в эритроцитах).

Таким образом, "Биотам" снижал накопление МДА во всех исследованных тканях, проявляя тем самым антиоксидантный эффект.

Антиоксидантным проявлениям соответствуют и результаты изучения динамики влияния "Биотама" на содержание МДА в эритроцитах при Т-2 токсикозе (табл. 2). Эти данные тем более показательны, поскольку при патологических процессах модификация эритроцитарных мембран отражаeт изменения, происходящие в плазматических мембранах других клеток [21].

Уже на 7-е сут наблюдения Т-2 токсикоз сопровождается значительным повышением содержания МДА в эритроцитах, которое наиболее выражено к 21 сут (до 96 %). Относительное снижение интенсивности процессов ПОЛ на 14 сутки (на 14-22 % выше контроля) может быть связано с активацией процесса эритропоэза как адаптационной реакции организма на снижение количества эритроцитов вследствие гемолиза. В результате этого появляются молодые, более устойчивые к влиянию гемолитика клетки, и повреждающее действие Т-2 токсина на мембрану эритроцитов менее заметно.

При хроническом воздействии Т-2 токсина процессы ПОЛ усиливаются и вызывают деструктивные изменения мембран. Подтверждением этому служит не только значительное увеличение содержания МДА в эритроцитах к 21 сут наблюдения, но и повышенное содержание диеновых конъюгатов в плазме крови: (17,58±1,07) мкг/мл (р<0,01) в группе, получавшей Т-2 токсин, по сравнению с (9,35±1,18) мкг/мл в контроле. Следовательно, Т-2 токсин приводит к возникновению свободнорадикальной патологии с накоплением как начальных, так и промежуточных продуктов липопероксидации.

На фоне введения препарата "Биотам" при Т-2 токсикозе отмечается положительная динамика снижения уровня ПОЛ: на 7 сут — до 25 %, на 14 сут — до 30 %, на 21 сут — до 50 % (табл. 2). Наблюдаемое повышение антиоксидантного статуса обусловлено эффектом устойчивого влияния вводимых микроэлементов на ферментный фон организма.

При Т-2 токсикозе повышенная активность свободнорадикальных процессов, обусловливающая накопление в крови супероксидных анионов, пероксидных радикалов, гидроперекисей и т.д., сопровождается активацией ряда антиоксидантных ферментов (табл. 3). Активность ГПО увеличивается на протяжении всего опыта и в сравнении с контролем на 21 сут повышается в 2 раза. Известно, что активность ГПО в клетках детерминируется интенсивностью образования восстановленного глутатиона в глутатионредуктазной реакции. Повышение активности этого фермента в условиях активизации липопероксидации, вызванной Т-2 токсином, является важным фактором предотвращения нарушения целостности мембран эритроцитов.

Рост активности ГР (максимальный на 7 сут) может быть связан с поддержанием восстановленного глутатиона в эритроцитах, поскольку ГР катализирует реакцию восстановления сульфгидрильных групп глутатиона. Низкомолекулярным тиолам и, прежде всего, глутатиону, принадлежит важная роль в поддержании резистентности клеток к действию повреждающих факторов [22]. Было установлено, что у крыс введение Т-2 токсина, стимулировавшее ПОЛ, было сопряжено со снижением пула восстановленного глутатиона и повышением активности глутатионтрансферазы [6]. Эта закономерность подтверждается у птиц: Т-2 токсин значительно снижает концентрацию восстановленного глутатиона во всех тканях (р<0,01) и повышает содержание его окисленной формы (табл. 4).

Так, концентрация общего глутатиона в крови снижалась на 24 %, восстановленного на 41 %; в то же время содержание окисленного глутатиона повышалось почти в 2 раза. Накопление перекисей в результате ПОЛ сопровождалось активацией глутатионпероксидазы, что приводит к интенсивному использованию восстановленного глутатиона и образованию окисленного глутатиона. Активизация ГПО и ГР является определяющим фактором, поддерживающим восстановительный потенциал глутатиона. Введение препарата "Биотам" способствует повышению интактного пула восстановленного глутатиона на 94 %, а на фоне Т-2 токсикоза поддерживает его на уровне контроля. Протекторный эффект "Биотама" наиболее выражен при введении большей дозы препарата (5 группа).

Известно, что ГТ осуществляет детоксикацию многих ксенобиоттиков [23, 24], а также Т-2 токсина [6] путем их конъюгации с глутатионом. В наших исследованиях при Т-2 токсикозе отмечено повышение активности ГТ, максимальное на 7 сут опыта (табл. 3). Увеличение активности ГТ при одновременном уменьшение содержания восстановленного глутатиона свидетельствует об образовании соответствующих конъюгатов на ранних сроках поступления токсина в организм. Снижение содержания восстановленного глутатиона может быть связано с образованием тиоловых конъюгатов с формами Т-2 токсина, а также, вероятно, с прямым взаимодействием нуклеофильной молекулы восстановленного глутатиона с Т-2 токсином. Усиление активности ГР объясняется также тем, что она играет стабилизирующую роль в поддержании клеточного пула восстановленного глутатиона, который необратимо расходуется в процесс конъюгации с Т-2 токсином и свободными радикалами, образовавшихся в результате липопероксидации.

Введение "Биотама" в группах 4 и 5 обусловливало значительное снижение активности ГТ в сравнении с влиянием Т-2 токсина (табл.3). При этом отмечены повышение восстановленной формы глутатиона во всех изучаемых тканях и нормализация активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах. Такой комплексный характер влияния препарата вполне закономерен, так как повышение в клетках восстановленной формы глутатиона уменьшает потребность его регенерации из дисульфидной формы и приводит к снижению до физиологического уровня активности ГР и ГТ.

При активизации процессов ПОЛ, вызванных Т-2 токсином, в эритроцитах наблюдается компенсаторное повышение СОД и метаболически связанной с ней каталазы (табл. 3). Введение препарата "Биотам", снижающего аномальное ПОЛ на фоне Т-2 токсикоза, приводит и к нормализации активности этих ферментов.

Исследование неферментативного звена антиоксидантной системы показало, что при Т-2 токсикозе происходит значительное снижение концентрации ретинола в печени (720,0±41,35 мкг/г; в контроле 912,0±48,92 мкг/г). Это соответствует ранее полученным данным о том, что Т-2 токсин, а также другие микотоксины существенно понижают уровень витамина А в организме птицы [25]. "Биотам" не только устраняет негативное влияние Т-2 токсина на содержание витамина А в печени (4 и 5 группы), но и обеспечивает повышение содержания витамина А в печени в сравнении с интактным контролем (1020,0±87,4 мкг/г и 990,0±76,48 мкг/г, соответственно).

Проведенные биофизические исследования позволили получить объективную информацию о состоянии и конформационных изменениях в мембранах эритроцитов и установить сдвиги популяций клеток крови при Т-2 токсикозе.

В условиях Т-2-токсикоза происходит нарушение однородности популяции эритроцитов, циркулирующих в кровеносном русле, на что указывает изменение среднего объема и диаметра эритроцитов (табл. 5).

Несмотря на колебания средних значений размеров эритроцитов, соответствующие физиологическому анизоцитозу, интегральные показатели, характеризующие относительное распределение клеток по объему и диаметру, свидетельствует о том, что Т-2 токсин приводит к развитию на 21-е сут явления микроцитоза, т.е. нарастанию субпопуляции эритроцитов с малыми размерами. Нарастающий микроцитоз может являться признаком токсического поражения организма и соответствовать как мембранопатиям, так и гематологическим расстройствам, подтверждаемым данными клинического анализа крови.

У кур, получавших токсин, в крови уменьшались содержание гемоглобина и гематокрит с тенденцией к снижению средней насыщаемости эритроцита железом. При введении "Биотама" эти проявления токсикоза полностью нивелировались. Более того,сам "Биотам" (группа 3) способствовал укреплению однородности и функциональной полноценности популяции клеток красного ростка кроветворения.

Свойства клеточной мембраны эритроцитов в значительной степени определяют электрические характеристики клетки. Изменение диаметра и объема клеток, нарушение микровязкости и интегральной целостности их клеточных мембран, вызванное активацией процессов перекисного окисления липидов, существенно влияет на величину электрического пробоя и электрической емкости мембран. При развитии Т-2 токсикоза происходят сложные нарушения физико-химических свойств мембран эритроцитов с изменением их устойчивости и проницаемости (табл. 6). Уже в ранние сроки после введения Т-2 токсина достоверно повышаются величины тока и напряжения электрического пробоя, которые остаются высокими и на 21-е сут. Одновременно снижаются показатели удельного сопротивления относительной проводимости цитоплазмы клеток.

Нарушениям проницаемости мембран в условиях токсического поражения соответствуют и показатели кислотного гемолиза эритроцитов (табл. 7).

На 7 сут интоксикации отмечается снижение времени гемолиза даже при низких концентрациях (0,0028 N) соляной кислоты при увеличении скорости проникновения гемолитика через мембрану. Эти данные говорят о том, что Т-2 токсин вызывает снижение устойчивости мембран "молодых", наиболее "прочных" в благоприятных физиологических условиях эритроцитов. В более продолжительные сроки наблюдения происходила нормализация показателей кислотного гемолиза.

"Биотам" вызвал достоверное увеличение прочности эритроцитарных мембран: при низкой концентрации соляной кислоты время гемолиза увеличивалось при снижении его скорости. При повышении концентрации гемолитика эти показатели были на уровне контрольных значений. Тот же эффект сохранялся в условиях совместного применения Т-2 токсина и "Биотама".

Выявленные на модели мембран эритроцитов изменения их структурно-функциональных свойств и электромеханических характеристик является отражением общих закономерностей мембранных нарушений, лежащих в основе молекулярных механизмов патологических изменений в тканях в условиях Т-2-токсикоза [26]. При воздействии Т-2 токсина происходит мобилизация ферментативной антиоксидантной защиты, что препятствует повреждению цитомембран. "Биотам" стабилизирует и укрепляет ферментный фон организма благодаря ферментимитирующей активности и прямому антиоксидантному действию его микроэлементных компонентов [10].

Выводы

1. Т-2 токсин является мощным стимулятором процессов перекисного окисления липидов, являющимся одним из механизмов нарушения целостности клеточных мембран.

2. Т-2 токсин вызывает вторичную свободнорадикальную форму патологии, что выражается в снижении содержания эндогенных антиоксидантов и существенном увеличении активности ряда антиоксидантных ферментов.

3. Одним из путей метаболической инактивации Т-2 токсина в организме является стимуляция глутатионовой системы.

4. Т-2 токсин способствует развитию мембранопатий и гематологических расстройств.

5. Благодаря ферментимитирующей активности и прямому антиоксидантному действию микроэлементных компонентов, препарат "Биотам" является эффективным антитоксическим средством при Т-2 токсикозе.

Література
1. Tobias S., Rajic J., Vanyi A. Effect of T-2 toxin on egg production and hatchability in laying hens // Acta veterinaria hungarica. —1992. —Vol .40, №. 1-2. Р. 47-54.
2. Котик А. Н., Микотоксикозы птиц. —Донецк: "Донеччина", 1999. —268 С.
3. Kurata H. Toxigenic fundi —their toxic and health hazard. —Elsevier: Amsterdam —Oxford-New York-Tokyo. —1984. —363 Р.
4. Shen H. M., Shi C. Y. Lee H. P., Ong C. N. Aflotoxin B-1 induced lipid peroxidation in rat — liver // Toxicology and applied pharmacology. —199. —Vol. 127, №.1 —Р.145-150.
5. Atroshi, F., Rizzo, A., Biese, I., Salonen, M., Lindberg, L.A., Saloniemi, H. Effect of feeding T-2 toxin and deoxinivalenol on DNA and GSH contents of brain and spleen of rats supplemented with vitamins E and vitamin C and Selenium combination // J. Animal Physiol. Animal Nutr. —1995. —Vol. 74. —Р. 157-164.
6. Okotio-Eboh G.O., Bailey C.A., Kubena L.F. Effect of beta-carotene and canthaxanthin on the susceptibility of cockerels to aflatoxicosis // Poulty Science /1991/ —Vol.70 —(Suppl. 1). —P.89-96.
7. Новожилов К.В., Левитин М.М. Направление исследований для решения проблемы фузуриоза колоса зерновых культур // Вестн. с.-х.наук. —1990. —№ 10. —С.64-67.
8. Jones F.T., Wineland M.J., Parsons J.T., Hagler W. Degradation of aflotoxin by poultry litter // Poultry Science. —1996. —Vol.75, № 1, P.52-58.
9. Френкель Л. А, Григор'єва Г. С., Конахович Н. Ф., Мохорт М. А. Фармокологічна корекція постпроменевих станів та аномалій гемопоезу координаційними сполуками металів // Укр. радіол. журн. —1999. —Т. VII, вип. 3. —С. 342-343.
10. Григорьева А.С. Оптимизация фармакотерапевтической активности биометаллов при комплексообразовании с НПВС // Микроэлементы в медицине. —2001. —Т. 2, вып. 1. —С. 17-22.
11. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal. Biochem. —1979. —Vol. 95. —P. 351-358.
12. Стальная М. Д. В кн. "Современные методы в биохимии" (под ред. В. М. Ореховича). —М.: Медицина, 1977. —С. 63–64.
13. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабор. дело. —1988. —№ 1. —С. 16-19.
14. Чевари С., Андял Т., Штренгер Я. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // Лабор. дело. —1991. —№ 10. С. 9-13.
15. Younes M., Schlichting R., Siegers C.-P. Glutathione-S-transferase activity in rat liver: effect of some factors influencing the metabolism of xenobiotics // Pharmacol.Res.Communs. —1980. —№ 2. —P. 115-129.
16. Надиров Н.К., Ленская Е.Н., Айдарханов Б.Б. Влияние витамина Е из отходов переработки хлопкового масла на глутатионпероксидазную активность крыс // Прикладная биохимия и микробиология. —1986. —Т.21, № 6. —С. 834-839.
17. Панченко Л. Ф., Герасимов А. М., Коон Я. М., и др. Повышение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы крыс при введении фенобарбитала // Фармакол. и токсикол. —1975 —Т. 28, № 3, —С. 334-337.
18. Штутман Ц.М., Артюх В.П. Вплив вітаміну Є та селену на включення гліцину-2-С14 та форміату-С14 у глутатіон печшнки щурів // Укр.біохім.журн. —1970. —Т.42, № 6. —С. 747-751.
19. Петрунькина А.М. Практическая биохимия. —Л.: Медгиз, 1961. —С. 152 —154.
20. Сурай П.Ф., Ионов И.А. Биохимические методы контроля метаболизма в органах и тканях птиц и их витаминной обеспеченности (Методические рекомендации). Харьков, 1990. —138 с.
21. Джагулова Н. Э., Баскович Г.А., Барышникова Г.В. и др. В кн. Антиоксиданты и адаптация. —Л., 1984. —С. 26 —34.
22. Nahm K.H., Karasawa Y. A study on the detoxification in the chick`s body of aflotoxin found in feed // Korean Journal of animal sciense. —1990. —Vol. 32. —P. 393-399.
23. Соколовский В. В. В кн. Антиоксиданты и адаптация. —Л., 1984. —С. 5–19.
24. Moron M.S., Depierre J.W., Mannervik B. Levels of glutathione, glutathione reductase and glutathione S-transferase activities in rat lung and liver // Biochem. Biophys. Acta. —1979. —Vol. 582. —P. 67-78.
25. Yuan Y.V., Kitts D.D. Endogenous antioxidants: role of antioxidant enzymes in biological systems. In: Shahidi F., ed. Natural antioxidants: Chemistry, Health Effects, and Applications, Illinois: AOCS Press, Champaign. —1997. —P. 258-270.
26. Шаповалов С.О., Ионов И.А. Влияние микотоксинов корма на физиолого-биохимические процессы в организме кур несушек // Тез.доклада V Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства". Горки —Беларусь, 2000. —С. 45-49.


| Содержание |