|
ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ДОСТИЖЕНИЯ В ОБЛАСТИ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОТДАЛЕННЫХ НЕЙРОПАТИЙ, ВЫЗВАННЫХ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев Начиная с 30-х годов нашего столетия описано более 40 000 случаев отравлений людей фосфорорганическими соединениями (ФОС), в результате которых возникали необратимые поражения нервной системы [1]. Этот эффект проявляется постепенно, после определенного латентного периода (обычно через 14-21 день, а иногда через 1-5 лет после перенесенного острого отравления) и характеризуется клинически — возникновением атаксии, мышечной слабости, парезов и параличей конечностей; морфологически — развитием процесса демиелинизации в центральной (головной, спинной мозг) и периферической нервной системе. По требованиям Всемирной организации здравоохранения препараты, оказывающие отдаленное нейротоксическое действие (ОНД), приводящее к стойкой потере трудоспособности людей, не допускаются к внедрению в практику. В связи с использованием фосфорорганических пестицидов (ФОП) в сельском хозяйстве (как самостоятельно, так и при совместном применении с синтетическими пиретроидами), а также в быту — одной из важнейших задач медицинской науки является необходимость еще на стадии экспериментального изучения прогнозировать их возможную опасность для здоровья людей и предупреждать внедрение в практику веществ, небезопасных для человека и окружающей cреды. В настоящем сообщении обобщены основные результаты исследований за последние 10 лет, которые проводились в отделе общей токсикологии Института экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя, о способности ряда ФОП оказывать ОНД; рассмотрены некоторые вопросы механизма, возможности прогнозирования и выявления ранних (доклинических) признаков нейропатии в эксперименте на различных видах лабораторных животных; обсуждаются соотношение между структурой ФОС и их свойствами оказывать ОНД, а также принципы профилактики и лечения указанной патологии. К настоящему времени механизм ОНД ФОС (пестициды, пластификаторы) окончательно не выяснен, не установлена прямая связь между их антихолинэстеразным и нейропаралитическим действием. Зарубежными исследователями [2] установлено, что ферментативной мишенью ОНД ФОС является специфический белок нервной ткани, так называемая "нейротоксическая" (нейропатическая) эстераза (НТЭ). Считают, что фосфорилирование эстеразы сопровождается гидролизом эфирной (Р-О-С) или амидной (Р-N-P) связей ФОС, приводящим к появлению кислой ионизированной группы. Важно, что торможение НТЭ регистрируется задолго до появления клинических признаков нейропатии. Сделан вывод, что развитие ОНД связано не только с угнетением НТЭ, но и последующим ее старением. Под "старением" понимают такое изменение структуры фосфорилированной НТЭ, в результате которого она теряет способность к реактивации. Ингибирование активности фермента менее чем на 70-80 % не обеспечивает такого "старения", и такие ФОС не вызывают ОНД. Схожесть гистопатологических изменений, а также однотипное влияние ФОС на НТЭ людей и кур позволяет использовать птиц для экспериментального моделирования нейропатий. При этом на секционном материале доказано, что НТЭ в головном мозге человека в 10-100 раз более чувствительна к воздействию ФОС чем у кур [3]. Удобной моделью для воспроизведения нейропатий являются также кошки и морские свинки. Установлено, что нейропаралитические ФОС (ТОКФ, лептофос) медленно метаболизируются в организме этих животных, что и определяет их видовую чувствительность. НТЭ обнаружена в нервной ткани (максимальная активность локализована в головном мозге), а также в сердце, селезенке, печени, лейкоцитах, тромбоцитах и лимфоцитах. Показана корреляция ингибирования НТЭ мозга и лимфоцитов периферической крови человека в опытах in vitro при воздействии ряда ФОС (мипафокс, лептофос, ТОКФ), что позволяет использовать лимфоциты периферической крови для мониторинга действия ФОС на человека [4]. Нами в опытах in vivо и in vitro (на самом чувствительном к этим эффектам виде животных — курах) исследовалась способность более 30 ФОП различной химической структуры оказывать ОНД. В результате проведенных исследований было установлено, что большинство из использованных соединений (этафос, гетерофос, бутифос, ортен, циклофос, хостаквик, гетерофос, офунак и др.) при введении птицам в токсических дозах (ЛД50) не обладают нейропаралитическим действием [5-9]. В то время, как фунгицид афос (0,0-дифенил-ацетоокси-2,2,2-трихлорэтилфосфонат) и его метаболит оксифосфонат оказывали более избирательное нейротоксическое действие, чем классические нейропаралитические агенты ТОКФ и лептофос [10-13]. Воздействие афоса в широком диапазоне доз (3000-25 мг/кг) сопровождалось снижением двигательной активности (атаксия), а через 2-3 недели развитием парезов и параличей у кур и морских свинок. Морфологические исследования выявили развитие процесса демиелинизации в ЦНС и периферических нервах животных. Подтверждено, что наиболее ранним (доклиническим) и в то же время достаточно информативным показателем проявления ОНД ФОС является резкое (на 80-90 % по отношению к контролю) угнетение активности НТЭ в головном и спинном мозгу птиц, которое регистрируется уже в первые 24 часа после воздействия оксифосфоната, афоса, ТОКФ и лептофоса. Важно, что эта же закономерность сохраняется и при использовании головного мозга кур в опытах in vitro. ФОС, не оказывающие нейропаралитического эффекта, слабо (на 4-30 %) ингибируют активность этого фермента [6]. В дальнейшем нами была усовершенствована экспериментальная модель для оценки и прогнозирования ОНД ФОП в опытах на грызунах. Так, впервые в опытах in vivо, а затем и in vitro установлено однонаправленное влияние ФОС на НТЭ головного мозга не только кур, но морских свинок и даже крыс [14-17]. Важно,что нет существенных различий в чувствительности НТЭ различных видов животных (куры, морские свинки, крысы) и в опытах in vitro. При этом процент ингибирования НТЭ (так же как и в опытах in vivо) составляет 75-90 % по отношению к контролю. Выявленный эффект позволяет рекомендовать использовать головной мозг не только кур, но и морских свинок и даже крыс для скрининга ФОС на ОНД. Важен также установленный нами факт, что угнетение НТЭ в головном мозге животных, а также человека (секционный материал) в опытах in vitro носит однонаправленный характер, что необходимо для экстраполяции полученных в эксперименте данных на человека [18] В опытах in vitro на модели отравления кур афосом впервые установлено однотипное влияние яда на активность НТЭ головного мозга птиц и лимфоциты периферической крови человека [19]. Разработанный нами метод определения активности фермента в периферической крови человека защищен авторским свидетельством и может быть использован для мониторинга воздействия ФОС в натурных условиях. Для исследования ОНД ФОС (ТОКФ, лептофос, афос и др.) в єксперименте на самом чувствительном к этим эффектам животных — курах нами был разработан доступный методический подход, позволяющий регистрировать функциональное состояние периферических аксонов птиц в динамике без оперативного вмешательства [20]. Установлено [11, 14], что наряду с угнетением НТЭ, доклиническим проявлением нейропатий является также резкое (на 38-42 % по отношению к контолю) замедление скорости распространения возбуждения по периферическим нервам кур, а также снижение амплитуды потенциала действия нерва. Наблюдаемое нами в латентном периоде (7 сутки), а затем на фоне клинической картины нейропатии (21 день исследования) замедление скорости распространения возбуждения при воздействии токсических доз афоса, оксифосфоната и лептофоса указывает на потерю возбудимости, в первую очередь, толстыми быстропроводящими нервными волокнами. Морфологические исследования выявили в седалищном нерве кур дегенерацию миелиновых волокон, очаговый зернистый распад миелина; в спинном мозге — ультраструктурные изменения нейроцитов, синапсов и нервных волокон. В ЦНС наблюдаются фазовые изменения ЭЭГ кур, характеризующиеся в первые дни воздействия ФОС (ТОКФ) повышением возбудимости, а на фоне развития параличей, наоборот, резким угнетением биоэлектрической активности [21]. По всей вероятности, угнетение активности НТЭ является пусковым механизмом развития нейропатий, а нарушение проводимостим по периферическим аксонам регистрируется уже на фоне начальных морфо-функциональных изменений миелина. В качестве промоторов ОНД ФОС может быть использован ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Исследованиями Lotti [22] показано, что если ФМСФ вводить животным после нейропаралитического агента, то это действие существенно усиливается. Поскольку чувствительность кур к агентам, вызывающим ОНД, ниже чем у человека применение промоторов может быть использовано для повышения чувствительности этой экспериментальной модели. Наши исследования [14, 23] подтвердили, что применение ФМСФ существенно повышает чувствительность экспериментальной модели при отравлении кур афосом в дозе 10 мг/кг, которая без использования промотора не вызывает клинических проявлений нейропатии. В то же время использование ФМСФ при воздействии токсических доз карбофоса и его метаболита — малаоксона [24] подтвердило отсутствие у этого пестицида нейропаралитического эффекта, что свидетельствует о том, что механизм его токсического действия не связан с влиянием на активность НТЭ . В опытах на курах, морских свинках и крысах установлено [25-27], что в патогенезе ОНД ФОС наряду с угнетение НТЭ существенное значение имеет место иммуннопатологический компонент (развитие аутоимунного процесса), а также усиление свободнорадикальных процессов в тканях нервной системы, о чем говорит увеличение активности супероксиддисмутазы и перекисного окисления липидов в головном мозге кур после введения ТОКФ и афоса. Развитие параличей сопровождается также понижением содержания цитохрома Р-450 в печени, а также свободных радикалов в скелетных мышцах и периферических нервах, что свидетельствует о нарушениях в мембранах клеток. В то же время угнетение активности карбоксилэстеразы, холинэстеразы, лизосомальных ферментов — не являются характерными для ФОС, обладающих нейропаралитическим действием, и эти показатели не могут быть использованы для дифференцированого прогнозирования данной патологии. Существенный интерес представляло исследование ОНД фенитротиона. Это обусловлено тем, что данные литературы о способности этого пестицида оказывать нейропаралитическое действие противоречивы. Так, в одних условиях эксперимента было показано [28], что фенитротион не обладает способностью вызывать атаксию, парезы и параличи у кур при введении в токсических дозах. Другие авторы [29] при введении фенитротиона в дозах 10 и 25 мг/кг на протяжении 8 недель наблюдали деструкцию миелина и снижение скорости распространения возбуждения по периферическим нервам кроликов. В этой связи нами были предприняты исследования по способности фенитротиона оказывать ОНД. Опыты проведены на курах (Leghorn), массой 1.6-2.0 кг. В контрольные и подопытные группы входило по 6 птиц. Фенитротион (50 % к.э.) в виде 10 % водной эмульсии вводили птицам в зоб однократно в дозе 300 мг/кг (ЛД50). Для повышения чувствительности экспериментальной модели был использован промотор ОНД ФОС — ФМСФ, который вводили курам в дозе 120 мг/кг до воздействия пестицида. Для предотвращения гибели подопытных животных использовали атропина сульфат (5 мг/кг), который вводили внутримышечно (три раза через каждые 2 часа) в первый день после воздействия фенитротиона. В качестве отрицательного контроля был использован классический нейропаралитический ФОС — ТОКФ (750 мг/кг). Наблюдение за развитием клинической картины интоксикации у кур после воздействия указанных ФОС осуществлялось на протяжении 30 дней эксперимента. Активность фермента НТЭ в головном мозге определяли через 24 часа после воздействия препаратов методом Johnson [30]. Функциональное состояние периферической нервной системы птиц оценивали по показателю — скорости распространения возбуждения (СРВ) по нерву n. fibularis в динамике (через 7, 14 и 21 день наблюдения). В конце опыта проводилось морфологическое исследование спинного мозга и периферических аксонов подопытных птиц. Результаты исследований показали, что клиническая картина интоксикации после однократного введения курам фенитротиона (300 мг/кг) и фенитротиона (220 мг/кг) совместно с ФМСФ (120 мг/кг) развивалась через 5-7 дней после воздействия указанных препаратов. При этом у птиц наблюдались: диаррея, усиленная саливация, понижение тонуса скелетных мышц. Электрофизиологический анализ функционального состояния двигательных аксонов птиц при воздействии фенитротиона и фенитротиона совместно с ФМСФ выявил на 7 сутки некоторое замедление СРВ на 30-33 % по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем, это изменение носило обратимый характер и к 14 дню исследования нормализовалось до уровня исходной величины. В то время, как при воздействии ТОКФ стойкое понижение СРВ сохранялось с 7 по 21 день опыта (рис. 1). Исследование активности фермента-мишени нейропаралитических ФОС — НТЭ при воздействии фенитротиона (в сравнительном плане с ТОКФ и промотором ФМСФ) представлено на рис.2. Как видно из полученных данных, фенитротион при введении в токсических дозах (ЛД50) слабо (на 29 %) ингибирует активность НТЭ в головном мозге кур. В то время как ТОКФ и ФМСФ вызывают существенное (на 89-79 % соответственно) угнетение этого фермента, что сопровождалось развитием у кур атаксии (7 сутки), а в дальнейшем (14-21 сутки) стойких парезов и параличей. Нейрогистологическое исследование подтвердило, что фенитротион, в отличие от ТОКФ, не вызывает развития процесса демиелинизации в центральной и периферической нервной системе кур. Таким образом, полученные нами экспериментальные данные на самом чувствительном к воздействию нейропаралитических ФОС виде животных курах свидетельствуют о том, что фенитротион не обладает способностью оказывать отдаленное нейропаралитическое действие, присущее ТОКФ [31]. Эффект отдаленной нейротоксичности обнаружен у ФОС различной структуры: фосфатов, фосфонатов, амидофосфатов. Сопоставление структуры ФОС и торможения НТЭ in vitro показало, что ФОС с гидрофильными и гетероциклическими заместителями, а также карбаматы наименее опасны в плане развития нейропатий. По способности оказывать ОНД фосфонаты более активны, чем фосфаты, тогда как фосфинаты этого эффекта не обнаруживали. Нейротоксичными являются большинство ФОС, содержащих 2,2 — дихлорвинильную уходящую группу, а также большинство алкилфенил-тиофосфонатов, имеющих структуру сходную с таковой лептофоса. При совместном воздействии ФОС с синтетическими пиретроидами не наблюдается усиления их нейротоксического эффекта [32, 33]. Закономерности структура — активность различны для острой токсичности и отдаленной нейротоксичности. Препаративные формы ФОС, как правило, в большей степени проявляют нейротоксическое действие, чем химически чистые исходные вещества. Нейротоксическая активность ряда ФОС может изменяться в процессе метаболизма. Так, метаболизм ТОКФ в организме животных протекает с образованием циклического соединения о- полициклосалегининфосфата, нейротоксические свойства которого выражены в 5 раз сильнее, чем у ТОКФ. В процессе превращения лептофоса образуются такие метаболиты, как лептофосоксон и десбромлептофос, которые в 2-3 раза активнее, чем лептофос. Метаболитом афоса является оксиосфонат, обладающий более сильным нейропаралитическим эффектом. В настоящее время отсутствуют эффективные средства лечения и предупреждения нейротоксического влияния ФОС замедленного типа. Использование с этой целью специфических средств (четвертичные реактиваторы холинэстеразы, холинолитики) предотвращает развитие лишь холинергических симптомов интоксикации. В качестве средств профилактики и лечения при интоксикациях ТОКФ рекомендуют витамины В6, В12, РР, альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, дибазол, фитин, гормональные препараты. Нами показано [34, 35], что комплексное использование центральных реактиваторов холинэстеразы (диэтиксим) и индукторов монооксигеназной системы (фенобарбитал) существенно ослабляет развитие нейропатий у кур и морских свинок, отравленных ТОКФ и лептофосом. Морфологические исследования подтвердили положительный эффект указанных лечебных средств на нервные структуры и скелетную мускулатуру. Установлено, что реактиватор холинэстеразы диэтиксим обладает способностью не только реактивировать фосфорилированную холинэстеразу, но и дефосфорилировать другие белки нервной ткани,в частности НТЭ, как в центральной, так и периферической нервной системе (при этом восстановление активности НТЭ составляет 25-30 %). Не исключена возможность прямого взаимодействия реактиватора с ФОС, что может приводить к обезвреживанию последнего. Фенобарбитал, по-видимому, способствует ускорению детоксикации ТОКФ и лептофоса, а возможно и их промежуточных продуктов. Вместе с тем при отравлении кур фунгицидом афосом использование перечисленных лечебных средств не оказывало положительного эффекта на развитие нейропатий. Безусловно, изыскание средств профилактики и терапии отравлений ФОС, обладающих нейропаралитическим свойством, нуждается в дальнейшей разработке. Заключение В связи с использованием ФОС в народном хозяйстве — проблема ОНД продолжает оставаться актуальной. Данные литературы и результаты наших экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что наиболее ранним пусковым механизмом в развитии ОНД является резкое ингибирование фермента-мишени — "нейротоксической эстеразы". ФОС, обладающие свойством оказывать ОНД, ингибируют активность НТЭ на 75 % и более уже в первые часы после воздействия. Препараты этой группы, не оказывающие нейропаралитического действия, угнетают активность фермента не более чем на 20-30 %. Для развития ОНД существенное значение имеют видовые различия скорости накопления, превращения и выделения веществ из организма. Так, у животных, медленно метаболизирующих нейротоксические ФОС, они длительно задерживаются в организме, что способствует развитию нейропатий. Поэтому, в частности куры, являются наиболее чувствительной моделью для обнаружения ОНД таких ФОС. По нашим данным, нет существенных различий в чувствительности НТЭ различных видов животных (куры, морские свинки, крысы) в опытах in vitro и in vivo к ФОС, облающим свойством оказывать ОНД. Это обстоятельство может быть использовано для прогнозирования ОНД. Ранним (доклиническим) признаком ОНД ФОС являются также снижение скорости распространения возбуждения по периферическим нервам и нарушение иммунного статуса организма. Чувствительность экспериментальной модели может быть существенно повышена путем использования промоторов ОНД. Установлено, что фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) оказывает промоторное действие по отношению к ОНД фунгицида афоса. В связи с наличием у афоса выраженного нейропаралитического дейстивия он был запрещен для применения в сельскохозяйственной практике. Использование промоторов (ФМСФ) подтвердило отсутствие нейропаралитического действия при воздействии карбофоса и фенитротиона (сумитион), что свидетельствует о том, что механизм их нейротоксического действия не связан с влиянием на активность фермента НТЭ. Нуждается в дальнейшей разработке изыскание средств профилактики и терапии отравлений ФОС, обладающих нейропаралитическим свойством. Следует продолжить изучение зависимости ОНД от структуры и физико-химических свойств веществ и механизма развития этого тяжелого поражения. Литература |