УДК 615.9+616.008

СОСТОЯНИЕ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА ПРИ ДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ

П.Г. Жминько, к.б.н.

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя МЗ Украины, Киев

Известно, что определяющим в механизме токсического действия фосфорорганических пестицидов (ФОП) является ингибирование активности холинэстеразы, играющей важную физиологическую роль [1, 2]. Однако, влияние ФОП на организм нельзя объяснить только лишь антихолинэстеразными свойствами. Токсическое действие их во многом зависит от систем, ответственных за гомеостаз, в частности монооксигеназной гидроксилирующей ферментной системы (МОГС) и иммунной системы. Роль МОГС в детоксикации и метаболических превращениях ФОП достаточно освещена в литературе [3, 4, 5], значение иммунной системы и, в частности, неспецифической реактивности организма (НРО), в этих процесах изучено недостаточно. Показано, что иммунная система, как и монооксигеназная, способна участвовать в биотрансформации ряда ксенобиотиков и играть существенную роль в их обезвреживании [6—9]. В настоящее время ведутся исследования по изучению роли циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) сыворотки крови в патогенезе ряда заболеваний, в том числе и химической природы [10-12]. Установлено, что ЦИК могут оказывать токсическое действие на ряд клеток и тканей организма и служить пусковым механизмом в развитии аутоиммунных заболеваний. В связи с этим, важной задачей является исследование токсических свойств ФОП в зависимости от состояния МОГС, иммунной системы и НРО, как систем эволюционно приспособленных для поддержания гомеостаза и защиты организма от экзогенных и эндогенных воздействий.

Материалы и методы исследований

Работа выполнена на крысах линии Wistar массой тела 180-200 г. Объектом исследований являлись производные тиофосфорной кислоты: гетерофос, 97 % (S-пропил-О-фенил-О-этилтиофосфат) и этафос, 93 % (S-пропил-О-2,4-дихлорфенил-O-этилтиофосфат), синтезированные в НИИХСЗР (г. Москва, РФ); тиоловый изомер циклофоса, 98,9 % (О,S-диметил-О-циклогексилтиофосфат) и тионовый изомер циклофоса, 99 % (О,О-диметил-О-циклогексилтиофосфат), синтезированные в Казанском ветеринарном институте (РФ).

Соединения вводили в желудок в виде равномерной эмульсии с ОП-7 однократно при помощи металлического зонда в дозах, соответствующих 1/2 ЛД₅₀ (гетерофос — 16 мг/кг, этафос — 175 мг/кг, тиоловый изомер циклофоса — 120 мг/кг, тионовый изомер циклофоса — 1450 мг/кг) и трехкрaтно в дозах, соответствующих 1/5 ЛД₅₀ (гетерофос — 6,4 мг/кг, этафос — 70 мг/кг, тиоловый изомер циклофоса — 48 мг/кг, тионовый изомер циклофоса — 580 мг/кг).

Состояние МОГС печени оценивали по интенсивности процесса N-деметилирования амидопирина методом T. Nash в модификации Cochin J., Axelrod J. [13] и содержанию цитохрома Р-450 в низкоспиновой форме, определяемого методом электронно-парамагнитного резонанса в условиях низкотемпературной стабилизации жидким азотом [14]. Исследования проведены на ЭПР-спектрометре фирмы "Вариан" Е-109 (США) совместно с Л.М. Овсянниковой и В.Я. Варич.

О неспецифической реактивности организма крыс судили по активности лизоцима в сыворотке крови [15], титру гетерофильных гемагглютининов (ГГА) методом Пауля-Бунеля [16] и уровню циклических иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови [17]. Для характеристики выраженности токсического эффекта ФОП определяли активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в эритроцитах методом [18]. Полученные результаты подвергали математической обработке методами вариационной статистики [19].

Результаты и их обсуждение

Установлено (табл. 1), что через 3 чac и 1 сyт после однократного воздействия гетерофоса, этафоса и тиолового изомера циклофоса в дозах, соответствующих 1/2 ЛД₅₀, наблюдалось выраженное ингибирование активности АХЭ. Степень ингибирования фермента составляла при действии гетерофоса 86,1 % и 80,7 %, этафоса — 95,1 % и 91,1 %, тиолового изомера циклофоса — 91,7 % и 82,7 %, соответственно. Восстановление активности фермента при отравлении гетерофосом и тиоловым изомером циклофоса отмечали через 7 сут, этафоса — после 15 сут. Тионовый изомер циклофоса антихолинэстеразным эффектом не обладал, наоборот, отмечали повышение активности фермента на протяжении 3 сут исследований.

При трехкратном введении (подострое воздействие)гетерофоса, этафоса и тиолового изомера циклофоса в дозах, соответствующих 1/5 ЛД₅₀, через 1 сут снижение активности АХЭ было в меньшей степени, чем при однократном воздействии, и составляло 58,1 %, 64,5 % e 73,7 %, соответственно. Однако, через 3 сут исследований при действии геторофоса отмечали накопление ацетилхолина и нарастание признаков интоксикации. Восстановление активности АХЭ при воздействии указанных веществ наблюдали в более поздние сроки, чем при остром отравлении. Тионовый изомер циклофоса через 1 сут незначительно (на 27 %) снижал активность АХЭ, в дальнейшем отмечали повышение активности фермента.

Полученые данные свидетельствуют о том, что гетерофос, этафос и тиоловый изомер циклофоса являются выраженными ингибиторами АХЭ. Тионовый изомер циклофоса в данных условиях опыта не обладает антихолинэстеразным эффектом. Незначительное снижение активности АХЭ при подостром воздействии можно объяснить тем, что под влиянием МОГС он медленно превращается в тиоловый изомер циклофоса, для которого характерен антихолинэстеразный эффект [20].

Исследование состояния ферментов МОГС печени показало, что однократное (1/2 ЛД₅₀) воздействие гетерофоса, этафоса и тиолового изомера циклофоса в течение 3 сут и тионового изомера циклофоса в течение 1 сут вызывает ингибирующий эффект (рис.1). Снижение активности n-деметилазы отмечали в большей степени, чем содержания цитохрома Р-450. По выраженности и стойкости эффекта изученные производные тиофосфорной кислоты можно расположить в таком порядке: тиоловый изомер циклофоса, этафос, гетерофос, тионовый изомер циклофоса. При действии гетерофоса (7 и 15 сут) и этафоса (15 сут) отмечали повышение интенсивности процессов n-деметилирования амидопирина в ткани печени крыс.

Трехкратное воздействие (1/5 ЛД₅₀) гетерофоса и этафоса на организм крыс характеризовалось разнонаправленным изменением показателей состояния МОГС печени (рис.1). В начальные периоды исследований наблюдалась индукция МОГС, через 7 сут — ингибирование, которое сменялось индукцией МОГС в конце опыта. Следует отметить, что под влиянием гетерофоса индуцирующее действие на МОГС печени крыс проявлялось повышением содержания цитохрома Р-450, этафоса — преимущественно индукцией процессов n-деметилирования амидопирина.

В данных условиях эксперимента тиоловый изомер циклофоса оказывал ингибирующий эффект на МОГС печени, который проявлялся более продолжительное время, чем при остром его воздействии. Тионовый изомер повышал активность N-деметилазы печени только на 3 сут исследований, изменений содержания цитохрома Р-450 не выявлено.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что в зависимости от дозы и времени воздействия гетерофос, этафос и тионовый изомер циклофоса оказывают разнонаправленное влияние на монооксигеназную систему печени крыс. При остром действии превалирует ингибирующий эффект на МОГС, при подостром — индуцирующий эффект. Тиоловый изомер циклофоса оказывает выраженное ингибирующее действие на МОГС как в остром, так и подостром опыте.

Сопоставляя данные об антихолинэстеразных свойствах веществ и их влиянии на МОГС можно заключить, что в условиях подострого опыта увеличение антихолинэстеразного действия гетерофоса, этафоса и тионового изомера циклофоса может быть связано с их активацией и образованием более токсичных соединений.

Ранее в опытах in situ было показано [20], что гетерофос и этафос подвергаются активации в печени с образованием более токсичных метаболитов, а тионовый изомер циклофоса в организме крыс способен подвергаться тион-тиольной изомеризации [21]. Как видно из представленных данных, однократное поступление производных тиофосфорной кислоты с Р=О связью (гетерофос, этафос, тиоловый изомер циклофоса) в больших дозах (1/2 ЛД₅₀) вызывают ингибирование МОГС, что может тормозить их собственный метаболизм, а индукция МОГС — способствовать повышению токсичности. Подтверждением этому является тот факт, что при подостром воздействии гетерофоса на 3 сут (в момент активации МОГС) отмечается полное угнетение АХЭ и повышается его токсический эффект. С активацией МОГС также связана антихолинэстеразная активность тионового изомера циклофоса, у которого атом фосфора связан двойной связью с серой (P=S).

Что касается этафоса, то несмотря на его меньшую токсичность по сравнению с гетерофосом и тиоловым изомером циклофоса, антихолинэстеразный эффект при его поступлении в организм наблюдается значительно дольше. Это, вероятно, связано с тем, что этафос обладает большим, чем другие исследованные ФОП, сродством к альбумину [22]. Поскольку связывание этафоса с альбумином носит обратимый характер, то постепенное высвобождение его из связанного состояния поддерживает во времени антихолинэстеразный эффект, что может играть существенную роль в механизме его кумулятивного действия.

Однако, неспецифическая сорбция сыворотки крови альбумином, очевидно, является не единственным местом потерь ксенобиотиков на пути к мишени. Таким местом потерь могут быть имуноглобулины крови, образующие с гаптеном иммунные комплексы.

При остром воздействии ФОП наблюдаются фазовые изменения исследованных показателей НРО.

Так, при однократном воздействии (1/2 ЛД₅₀) гетерофоса и этафоса (табл. 2) в 1 сут исследований отмечается повышение активности лизоцима в сыворотке крови крыс, на 3 сут — ингибирование активности фермента, которое в последующие сроки исследований сменяется индукцией (в случае этафоса), либо наблюдается восстановление активности фермента с дальнейшим незначительным снижением его активности к концу эксперимента (в случае гетерофоса). При воздействии тионового изомера циклофоса, наоборот, через 3 час и 3 сут выявлен ингибирующий эффект на активность лизоцима, на 7 сут — отмечали индукцию с последующим восстановлением активности фермента. Тиоловый изомер циклофоса вызывал только повышение активности лизоцима на 7 сут исследований.

В различные сроки исследований наблюдалась тенденция к увеличению титра ГГА при действии гетерофоса, этафоса, тионового изомера циклофоса и незначительное снижение данного показателя при действии тиолового изомера циклофоса (рис.2). Выявленные изменения титра ГГА не были достоверными.

Как показано на рис. 3, достоверное повышение уровня ЦИК в сыворотке крови отмечалось при действии всех изученных веществ: гетерофоса — через 3 час, 3 и 7 сут; этафоса и тиолового изомера циклофоса — 3 и 7 сут; тионового изомера циклофоса — в течение 3 сут исследований. Наибольший уровень ЦИК выявлен на 3 и 7 сут, в момент восстановления активности МОГС печени.

При подостром воздействии ФОП активность лизоцима сыворотки крови изменялась только в начальные сроки исследований. Отмечали повышение активности фермента при действии гетерофоса на 45 %, этафоса — 75 % и снижение — под влиянием тионового изомера циклофоса на 76 %. Достоверных изменений титра ГГА не выявлено, однако отмечалась тенденция к их увеличению при воздействии гетерофоса, этафоса и тионового изомера циклофоса. Повышение уровня ЦИК, по сравнению с данными острого опыта, было менее выраженным и достигало максимума на 3 сут исследований.

Учитывая, что повышение уровня ЦИК не сопровождалось усилением токсического действия препаратов, а также то, что к концу эксперимента их уровень у животных не отличался от контроля и отмечали преимущественно повышение активности лизоцима сыворотки крови, косвенно свидетельствующее об активации процесса фагоцитоза [23], можно предположить, что ЦИК элиминируются из организма.

Таким образом, повышение неспецифической реактивности организма, очевидно, следует расценивать как проявление защиты, направленное на восстановление нарушенного гомеостаза.

Литература
1. Maxwell D.M., Lenz D.E. Structure-activity relationships and anticholinesterase activity // Clinical and Experimental Toxicology of Organophosphates and Carbamates. Foreword by W.N. Aldridge. —Butterword-Heinemann Ltd. —1992. —P. 47-58.
2. Фосфорорганические инсектициды: общее введение. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 63. Всемирная организация здравоохранения. —Женева, —1990. —168 с.
3. Розенгарт В.И., Шерстобитов О.Е. Избирательная токсичность фосфорорганических инсектоакарицидов. Сравнительно-биохимические аспекты / Под ред. A.П.Бересткина. —Л.: Наука, Ленинградское отд., —1978. —173 с.
4. Каган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. —К.: Здоров`я, —1981. —170 с.
5. Михайлов С.С., Щербак И.Г. Метаболизм фосфорорганических ядов. —М.: Медицина, —1983. —112 с.
6. Ковалев И.Е, Полевая О.Ю. Антитела к физиологически активным соединениям. —М.: Медицина, —1981. —126 с.
7. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Иммунологические механизмы клеточного гомеостаза // Гомеостаз. Под ред. Горизонтова П.Д. —М.: Медицина, —1981. —С. 312-362.
8. Караулов А.В.. Храменков Ю.А., Саприн А.И. О роли лимфоцитарного цитохрома Р-450 в поддержании иммунного гомеостаза // Регуляция иммунного гомеостаза. Материалы докладов III Всесоюзного симпозиума. —Ленинград, —1982. —С. 146-148.
9. Ковалев И.Е., Шипулина Н.В. Иммунохимические механизмы адаптации организма к окружающей среде // Изв. АН СССР. —Серия биол. —1992. —№ 1. —С.31-41.
10. Сура В.В., Насонов Е.Л., Борисов И.А., Тимофеева Е.Б. Клинико-патологические закономерности развития болезней и иммунных комплексов // Терапевт. арх. —1980. —Т. 11, —№ 12. —С. 3-10.
11. Иммунореактивность и атеросклероз / Под ред. A.Н.Климова. —Л.: Медицина, —1986. —С. 107-140.
12. Попко В.И. Патогенетическая роль циркулирующих иммунных комплексов при остром ингаляционном отравлении свекловодов гербицидом 2,4-Д // Акт. пробл. токсикол. Тезисы докладов. Научная конф. посвященная 75-летию со дня рождения чл.-корр. НАН и АМН Украины, проф., д.м.н. Ю.С.Кагана, 7-8 октября 1999 г. Киев. —ЭКОГИНТОКС, —1999. —С. 69-70.
13. Cochin I., Axelrod I. Biochemical and pharmacological changes in the rat following chronic administration of morphine, nalorphine and normorphine // J. Pharmacol. Exp. Therap. —1959. —Vol. 125, —N 2. —P. 105-109.
14. Hashimoto J., Jamano T., Mason H.S. An electron spin resonance study of microsomal electron transport // J. Biol. Chem. —1962. —Vol. 237, —N 12. —P. 3843-3844.
15. Карпенко В.С., Колесников Г.Ф., Петрунь Н.М., Романенко В.А. и соавторы. Турбидиметрический метод определения активности лизоцима в сыворотке крови и моче Смолялиса и Гартсела (1949) в модификации Харрисона и соавторов (1968) // Функциональная диагностика в урологии и нефрологии. —Киев: —Здоровье, —1977. —С. 83-85.
16. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике.- Киев. —Здоровўя, —1978. —С. 20-21.
17. Гриневич Ю.А., Алферов А.Н. Определение иммунных комплексов // Лаб. дело. —1981. —№ 8. —С. 493-496.
18. Hestrin S. The reaction of acethylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine and its biological application // J. Biol. Chem. —1949. —V. 180, —P. 249-261.
19. Плохинский М.А. Алгоритмы биометрии / Под ред. Гнеденко Б.В. —М.: Изд. Московского госуниверситета, —1980. —150 с.
20. Ершова Е.А., Жминько П.Г. Роль монооксигеназной гидроксилирующей ферментной системы печени в тион-тиольной изомеризации циклофоса // Всес. семинар "Химия физиологически активных соединений", 13 —15 ноября 1989. —Тез.докл. —Черноголовка, —1989. —С. 96.
21. Каган Ю.С., Ершова Е.А., Леоненко О.Б., Жминько П.Г. Клисенко М.А., Зейналова Т. Роль монооксигеназной системы в метаболизме и механизме действия некоторых пестицидов // Вестн. АМН СССР. —1988, —№ 1, —C. 70-76.
22. Луйк A.И., Лукьянчук В.Д. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. -М.: Медицина, -1984. -С. 117-136.
23. Последние достижения в клинической иммунологии / Под ред. Р.A.Томпсона. Перевод с англ. Г.A.Космиади. —М.: Медицина, —1983. —С. 375-388.