УДК 614.715: 612.112.3 : 57.083.3

ИЗМЕНЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КСЕНОБИОТИКОВ, ВУЛКАНИЧЕСКОЙ ПЫЛИ И ЧАСТИЦ ВОЗДУХА 1648

Т.Ю. Гоц, к.м.н.

Киевская медицинская академия последипломного образования им. П.Л. Шупика МЗ Украины

Макрофаги являются важными, клетками легких, ответственными за поддержание чистоты и стерильности этого органа. Они принимают участие в регуляции нормального иммунного ответа легких и способны опосредовано модулировать ответные реакции других клеток легких через высвобождение медиаторов. Повреждение макрофагов различными ксенобиотиками может в значительной степени отразиться на здоровье человека.

Стволовые клетки костного мозга являются источником образования макрофагов. Монобласты превращаются в промоноциты, а затем в моноциты. Моноциты задерживаются в костном мозге на непродолжительное время, а затем перемещаются в различные органы и ткани, где находятся в течение 36-104 час [1]. При переходе в ткани моноциты превращаются в макрофаги. Оказавшись в легких, макрофаги переходят в разряд относительно долгоживущих клеток, с продолжительностью жизни до нескольких месяцев [2]. Созревание моноцитов в макрофаги происходит под влиянием не менее трех факторов: генетического программирования, факторов роста и цитокинов, окружающей их легочной ткани. Существует предположение, что все эти три фактора играют роль в определении фенотипа будущего макрофага.

Субпопуляции альвеолярных макрофагов характеризуются по наличию определенных маркеров на их поверхности. Альвеолярные макрофаги (АМ) представляют собой гетерогенную популяцию фагоцитов, которые пребывают на разных стадиях активации и дифференцировки [3]. Эти клетки способны изменять принадлежность к определенному фенотипу, который регулирует их функциональные свойства за счет мембранных антигенов [4] Модуляция мембранных антигенов, вероятно, помогает АМ эффективно регулировать фагоцитирующую активность в легких.

Исследования по изучению роли мембранных гликопротеинов, относящихся к семейству интегринов, показали их фундаментальную роль в осуществлении миграции макрофагов и их нормального функционирования [5]. В частности, b₂-интегрины (CD11/ CD18, лейкоцитарные интегрины) и их лиганды участвуют во взаимодействии бронхоальвеолярных клеток друг с другом и их количество на мембране АМ вариирует при разных патологических процессах в паренхиме легких [6]. Например, на поверхности макрофагов обнаруживаются CD 11a, CD 11b и CD 11c маркеры. У здоровых людей субпопуляция макрофагов, несущая на своей поверхности маркер CD 11b, составляет 52 % клеток, и увеличивается до 83 % у больных саркоидозом [7]. Другой поверхностный маркер, молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) обнаруживается на поверхности 39 % макрофагов здоровых людей, но у больных саркоидозом содержание этой популяции макрофагов возрастает до 84 %. Следовательно, фенотип макрофагов может изменяться в условиях патологии.

Макрофаги, проявляющие свойства дендритных, фагоцитирующих или супрессивных клеток могут быть идентифицированы на основании экспрессии мембранных антигенов RFD1, RFD7, RFD9. Дополнительным признаком отличия субпопуляций макрофагов служат маркеры RFD1⁺ и RFD7⁺, впервые выявленные и изученные Poulter et al. [4, 8]. RFD1⁺ представляет собой белок главного комплекса гистосовместимости II (MHC II) с молекулярной массой 28-33 кДа; RFD7⁺ является белком с молекулярной массой 77 кДа и определяется на поверхности фагоцитирующих макрофагов. На основе наличия этих маркеров макрофаги были классифицированы как антиген-представляющие клетки (АРС). К ним относятся макрофаги, несущие на своей поверхности RFD1⁺, RFD7^- белок. Эти дендритоподобные клетки являются активными стимуляторами Т-лимфоцитов, содержат небольшое количество внутриклеточного флюоресцирующего материала, не прикрепляются к стеклу и слабо участвуют в процессе фагоцитоза (9). Макрофаги, несущие на своей поверхности RFD1^-, RFD7⁺ белок, представляют собой эффекторные клетки, а RFD1⁺, RFD7⁺ — супрессорные клетки. Обе эти популяции содержат значительное количество внутриклеточного флюоресцирующего вещества и обладают значительной фагоцитарной активностью. Кроме того, RFD1⁺, RFD7⁺ несущие макрофаги слабо стимулируют аллогенные лимфоциты, но активно подавляют способность RFD1⁺, RFD7 — макрофагов стимулировать Т-клетки [9-10].

Обследования больных с различными воспалительными заболеваниями подтвердили, что изменение фенотипа альвеолярных макрофагов, увеличение соотношения RFD1⁺/RFD1⁺7⁺ может играть существенную роль в развитии патологического процесса.

На рис.1 представлены различия в соотношении rfd1⁺, rfd7⁺ и rfd1⁺, 7⁺ субпопуляций макрофагов перибронхиальной ткани здоровых людей и больных бронхиальной астмой [10].

В условиях нормы макрофаги, обладающие супрессорной активностью, являются доминирующей субпопуляцией, предотвращающей развитие иммуностимуляции и воспаления. В условиях патологии увеличивается количество антиген-презентирующих клеток, стимулируя активность иммунного ответа.

CD 80 (B 7.1) и CD 86 (B 7.2) также служат маркерами различных субпопуляций альвеолярных макрофагов. CD 80 и CD 86, располагаясь на поверхности макрофага, взаимодействуют с главным комплексом гистосовместимости II и Тх 1 Тх 2 клетами (Th1, Th2) [11]. Интерлейкин-12 (ИЛ-12, IL-12) регулирует экспрессию этих протеинов на поверхности макрофагов и, следовательно, активность Т-хелперов [12].

Индивидуальная экспрессия вышеописанных и других поверхностных маркеров субпопуляций макрофагов у людей значительно вариирует и служит, в основном, для индикации воздействия ксенобиотиков.

Целью нашего исследования была проверка гипотезы, что пылевые токсические частицы 1648 могут вызывать изменение фенотипа альвеолярных макрофагов человека in vitro.

Материалы и методы исследования

Альвеолярные макрофаги человека получали при проведении бронхоальвеолярного лаважа у 20 здоровых некурящих добровольцев. 200-250 мл лаважной жидкости сохранялось при температуре 4°С до момента выделения клеток путем центрифугирования. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в небольшом количестве HEPES буфера и среды 199 (Gibco BRL, USA) с добавлением 10 % бычьего альбумина (FBS, Sigma , USA) и антибиотоков. В процессе лаважа удавалось выделить в среднем 2•10⁷ клеток. Более 94 % составляли альвеолярные макрофаги, жизнеспособность которых была более 90 %.

АМ инкубировали в количестве 1•10⁶ клеток/мл со 100 мкг/мл вулканического пепла и 100 мкг/мл частиц 1648 при температуре 37°С в течение 24 час. В контрольном образце инкубировали только клетки.

Частицы вулканического пепла были диаметром от 0,7 до 2,2 мкм. Основным содержащимся в них элементом был Si. В небольшом количестве определялись Ca, Mg и Na. Частицы 1648 имели диаметр от 0,2 до 0,8 мкм, а основными содержащимися в них химическими элементами были Si, S, Fe, Al и K.

После окончания инкубации культуры клеток центрифугировали на микроцентрифуге 5415С (Brinkman Instruments, Germany) при скорости 12000 х g в течение 20 с. Среду, в которой культивировали клетки, удаляли, а клеточный осадок (0,5•10⁶ клеток) ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера с добавлением 3,5 % бычьего сывороточного альбумина. Моноклональные антитела к RFD 1 поверхностным антигенам (мышиный IgM) и RFD 7 (мышиный IgG1) производства Serotec, Kidington, Oxford (England) добавляли в разведении 1:200. Полученные образцы инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Процесс инкубации заканчивали центрифугированием и аспирацией надосадочной жидкости. Клеточный осадок промывали 3 раза раствором фосфатного буфера. Осадок вновь суспендировали в фосфатном буфере с добавлением бычьего сывороточного альбумина. Флюоресцирующий антимышиный IgM и антимышиный IgM, меченый R-фикоэритрин (Vector Laboratories, USA), были добавлены в разведении 1:100 и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации клеточный осадок промывали 3 раза с использованием фосфатного буфера. Клетки суспендировали в 1 % растворе формальдегида в фосфатном буфере и сохраняли при 4°С до проведения цитометрического анализа.

Флоуцитометрический анализ проводили с помощью FACScan флоуметра (Becton-Dickinson) с использованием программного обеспечения 30.

Статистическую разницу между контрольными и экспериментальными образцами рассчитывали на основе анализа вариабельности (ANOVA) после определения коэффициента Student Newman-Keuls. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Результаты влияния вулканической пыли и частиц воздуха 1648 на распределение фенотипов альвеолярных макрофагов человека после 24-часовой инкубации in vitro представлены на рис. 2. После инкубации АМ с 100 мкг/мл вулканической пыли клетки, принадлежащие к RFD1⁺ фенотипу составили 5±0,8 % всей популяции макрофагов, а клетки, принадлежащие к RFD1⁺ 7⁺ фенотипу — 2±0,03 %.

После инкубации АМ с 100 мкг/мл частиц воздуха 1648 количество RFD1⁺ фенотипа клеток увеличилось до 14±1,2 %, однако количество RFD1⁺ 7⁺ клеток практически не изменилось и оставалось на уровне контроля (3±0,04 %).

Таким образом, количество RFD1⁺ клеток (стимуляторные клетки) после 24 час инкубации с вулканической пылью практически не изменялось. После инкубации АМ частицами воздуха 1648 отмечалось значительное (более, чем в 2 раза) увеличение количества клеток RFD1⁺ фенотипа без изменения фенотипа клеток RFD1⁺ 7⁺ (супрессорные клетки).

Распределение фенотипов альвеолярных макрофагов у человека зависит от его индивидуальных особенностей, однако, изменяется в сторону увеличения провоспалительного пула клеток при наличии воспалительных процессов [9].

Влияние токсических частиц воздуха на людей с повышенной чувствительностью может способствовать изменению фенотипов АМ. Это может частично объяснять зависимость между ухудшением состояния больных с различными хроническими заболеваниями легких и загрязнением воздуха озоном или табачным дымом, которые обладают выраженной иммуносупрессивной активностью.

Литература
1. Furth RV., Cohn ZA., Hirsch JG. et al. The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells.// Bull World Health Organ. —1972. —V. 46. —P. 845-852.
2. Thomas ED., Ramberg RE., Sale GE. et al. Direct evidence for a bone marrow origin of the alveolar macrophage in man .// Science. —1976. —V. 192. —P. 1016-1018.
3. Semenzato G. Immunology of interstitial lung diseases: cellular events taking place in the lung of sarcoidosis, hypersensitivity pneumonitis and HIV infection.// Eur Respir J. —1991. —V. 4. —P. 94-102.
4. Spiteri MA., Clarke SW., Poulter LW. Alveolar macrophages that suppress T-cell response may be crucial to the pathogenic outcome of pulmonary sarcoidosis.// Eur Respir J. -1992. —V. 5. —P. 394-403.
5. Albert RK., Embree LJ., McFeely JE. et al. Expression and function of b2 —integrins on alveolar macrophages from human and nonhuman primates.// Am J Respir Cell Mol Biol. —1992. —V. 7. —P. 182-189.
6. Striz I., Wang YM., Kalaycioglu O. et al. Expression of alveolar macrophage adhesion molecules in pulmonary sarcoidosis.// Chest. —1992. -V. 102. —P. 882-886.
7. Striz I., Wang YM., Svarcova I. et al. The phenotype of alveolar macrophages and its correlation with immune cells in bronchoalveolar lavage. // Eur Respir J. —1993. —V. 6. —P. 1287-1294.
8. Spiteri MA., Poulter LW. Characterization of immune inducer and suppressor macrophages from the normal human lung. // Clin. Exp. Immunol. —1991. —V. 83. —P. 157-162.
9. Van Haarst JMW., Hoogsteden HC., de Wit HJ. et al. // Dendritic cells and their precursors isolated from human bronchoalveolar lavage: immunologic and functional properties. // Am. j. Respir .Cell. Mol. Biol. —1994. —V. 11. -P. 344-350.
10. Poulter LW., Burke CM. Macrophages and allergic lung diseases. // Immunobiology. —1996. —V. 81. -P. 979-982.
11. Thompson CB. Distinct roles for the costimulatory ligands B7-1 and B7-2 in T helper cell differentiation // Cell. —1995. -V. 81. -P. 979-982.
12. Ding L., Linsley PS., Huang LY. et al. IL-10 inhibits macrophage costimulatory activity by selectively inhibiting the upregulation of B7 expression // J. Immunol. —1993. —V. 151. —P. 1224-1234.