ТОКСИКОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВ

УДК 615.9: 615.015

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ОТЕЧЕСТВЕННОГО АНТИМИКОТИКА ТЕОБОНА-ДИТИОМИКОЦИДА

Л.М. Сасинович, д.м.н., Ю.С. Каган, член-корр. АМН Украины, Е.А. Баглей, д.м.н., Н.Н. Недопитанская, к.б.н., Н.А. Корнута, к.б.н., В.Г. Коляденко, д.м.н., проф., член-корр. АПН Украины, В.И. Степаненко, д.м.н., проф., Л.Н. Шкарапута, д.т.н., проф., В.В. Даниленко, к.т.н., Л.А. Тищенко, к.х.н., В.М. Мячин

Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины,
Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя МЗ Украины,
Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца

В последние годы во всем мире отмечается рост микозных заболеваний кожи. Ими страдают около 20 % трудоспособного населения и 65-70 % людей пожилого возраста. Наиболее значимыми в этиологии микозов являются смешанные грибково-бактериальные ассоциации [1-3]. Широкая распростра-ненность заболеваний, быстрая адаптация возбудителей к лекарствам, с одной стороны, небольшой ассортимент доступных мало токсичных и высокоэффективных противогрибковых препаратов, с другой, затрудняют лечение микозов. С учетом этого, в Институте биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины создан новый противогрибковый препарат широкого спектра действия Теобон-дитиомикоцид, обладающий также бактерицидной активностью.

В процессе доклинических испытаний, выполненных согласно требованиям [4, 5], выявлена высокая фунгицидная и бактерицидная активность Теобона-дитиомикоцида относительно грибов (Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Candida albicans, Candida tropicalis) и бактерий (Escherichia Coli, Staphylococus aureas, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Aerobacter aerogenes). Результаты клинических испытаний, выполненных на кафедре дерматовенерологии Киевской медицинской академии последипломного образования, на кафедре кожных и венерических болезней Национального медицинского университета и в Киевском областном кожно-венерологическом диспансере, показали, что Теобон-дитиомикоцид при местном лечении таких заболеваний, как рубромикоз, микоз, кандидоз, микроспория, трихофития, по эффективности не уступает зарубежным антимикотикам клотримазолу (производства "Польфа", Польша) и микозолону (производства "Gedeon Richter", Венгрия).

Цель нашей работы — изучение токсического влияния теобона-дитиомикоцида на организм лабораторных животных.

Материалы и методы исследования

Изучали препарат Теобон-дитиомикоцид, 99,5 % действующего вещества, представляющего собой N-(1,1-диоксотиолан-3-ил)дитиокарбамат калия. Препаративная форма: водный раствор (5, 10 и 30 %), 10 % мазь на основе ланолина.

В эксперименте использовали половозрелых животных обоих полов: белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов. Изучали острую токсичность, кумулятивные свойства, кожно-резорбтивное, местно-раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки, аллергенные свойства; влияние на показатели, характеризующие состояние сердечно-сосудистой, дыхательной, центральной нервной системы, печени, почек, крови; возможность возникновения отдаленных эффектов действия (мутагенного, канцерогенного, тератогенного, эмбриотоксического и влияния на репродуктивную функцию).

Острую токсичность оценивали по интегральному показателю ЛД50 [6].

Кожно-резорбтивное и местно-раздражающее действие на кожу изучали путём погружения хвоста крыс в водные растворы Теобона-дитиомикоцида [7] и посредством аппликации на кожу крыс, морских свинок и кроликов водных растворов препарата и мази на основе ланолина. Способность раздражать слизистые оболочки исследовали, внося водные растворы вещества в конъюнктивальный мешок глаза кроликов [8].

Кумулятивные свойства Теобона-дитиомикоцида в организме оценивали при пероральном (200 мг/кг) и накожном (400 мг/кг) ежедневном воздействии в течение 2 мес [9].

Аллергенные свойства исследовали на морских свинках белой масти или с белыми пятнами на боку туловища посредством внутрикожной и накожной сенсибилизации [10].

Спустя 1 и 14сут после нанесения разрешающей дозы из сердца подопытных и интактных животных брали кровь и определяли иммунологические показатели: реакцию специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ), реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) и реакцию дегрануляции тучных клеток (ДТК).

Основные физиологические параметры, характеризующие функциональное состояние организма, определяли на электронном многоканальном приборе "Полиграф П6-4-01" [11, 12]. В хроническом эксперименте (2 мес) [5] изучали состояние сердечно-сосудистой системы (ЭКГ, центральная гемодинамика: минутный и ударный объем крови, частота сердечных сокращений), внешнего дыхания (минутный объем дыхания, объем вдоха и выдоха, частота дыханий), центральной нервной системы (двигательная активность, ориентировочно исследовательские реакции, эмоциональная реактивность, суммация подпороговых потенциалов — СПП).

Морфологический состав периферической крови исследовали унифицированным методом [8].

Состояние печени отражали результаты определения в плазме и в печени активности аланинамино-транферазы — АЛТ (К.Ф. 2.6.1.2.) и аспартатамино-трансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.) [13], щелочной фосфатазы — ЩФ (К.Ф. 3.1.3.1.) [13], холинэстеразы — ХЭ (К.Ф. 3.1.1.8) [13], содержания общего белка и соотношения белковых фракций [14], содержания холестерина и фосфолипидов [15] в сыворотке крови.

О состоянии почек судили по величине диуреза, содержанию в моче общего белка [14] и хлоридов, в сыворотке и моче — мочевины [13].

Исследовали: активность монооксигенозной системы — МОГС [16], деметилазы амидопирина — ДА [16], об интенсивности процессов переокисления липидов судили по содержанию малонового диальдегида — МДА [17, 18] Антиоксидантную активность оценивали по результатам определения каталазы [19], и пероксидазы [13], а также сульфгидрильных групп [20].

Патоморфологическому исследованию были подвергнуты печень, почки, мозг, сердце, легкие, селезенка, надпочечники. Материалы фиксировали в 10 % нейтральном формалине, 80° спирте, жидкости Карнуа и Жандра. Часть срезов окрашивали гематоксилином и эозином [8].

Срезы кожи толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления коллагеновых волокон — пикрофуксином по Ван Гизону, эластических волокон — резорцин-фуксином по Вейгерту. Для выявления аргирофильных волокон образцы кожи импрегнировали азотнокислым серебром по Футу.

Мутагенное, тератогенное, эмбриотоксическое действие и влияние на репродуктивную функцию изучали согласно [4, 8, 21].

Для оценки канцерогенной активности Теобона-дитиомикоцида были использованы методические подходы Международного Агентства по Изучению Рака [22].

Генотоксическая (инициирующая) активность изучена методом щелочной элюции ДНК, которую оценивали по количественным характеристикам разрывов [23, 24]. Одним из наиболее ранних показателей повреждения ДНК являются однонитчатые разрывы. Анализ результатов элюции ДНК клеток из различных органов млекопитающих, получавших исследуемое вещество, позволит прогнозировать потенциальную опасность его бластомогенного действия.

Исследование промоторного канцерогенного действия Теобона-дитиомикоцида проведено на модели гепатоканцерогенеза "НДЕА-гепатэктомия" и мультиорганной модели по схеме N. Ito [25].

Результаты обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента [26].

Результаты и их обсуждение

Установлено, что Теобон-дитиомикоцид малотоксичен для лабораторных животных. ЛД50 при введении в желудок белым мышам (самцам и самкам) — 1250 мг/кг, белым крысам (соответственно, самцам и самкам) 3950 мг/кг и 2133 мг/кг. Разница в чувствительности животных к воздействию препарата в зависимости от их вида выражена умеренно: коэффициент видовой чувствительности 1,7-3.

Животные, получавшие вещество в токсических дозах, становились апатичными, не принимали воду и корм, наблюдалось нарушение координации движений, затем принимали боковое положение и в течение 2 сут погибали. При вскрытии отмечали полнокровие печени, иногда вздутый желудок. Выживаемость отравленных крыс увеличивалась примерно на 22 % в случае лечения их унитиолом (однократное введение под кожу 0,2 мл 5 % раствора), рекомендованным для терапии интоксикаций дитиокарбаматами.

Кожно-резорбтивное и местно-раздражающее действие Теобона-дитиомикоцида не выражено ни при погружении хвоста крыс в 30 % раствор, ни при нанесении на кожу белым крысам, морским свинкам, кроликам в виде 30 % водного раствора в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг. Животные при этом не погибали, видимых признаков интоксикации у них не наблюдали. Кожа на месте нанесения препарата была чистая, без признаков раздражения. Температура кожи и толщина кожной складки были такими же, как и у контрольных животных. После внесения препарата (3 капли 30 % водного раствора) в конъюнктивальный мешок глаза кролика наблюдали кратковременное слезотечение, слизистая оболочка глаза была слегка гиперемирована. Спустя 1 сут эти явления полностью исчезали.

Аллергенные свойства у Теобона-дитиомикоцида не были выявлены. Об этом свидетельствовали отсутствие реакции на введение вещества в разрешающей дозе после внутрикожной и накожной сенсибилизации, а также результаты исследования иммунологических тестов: РСЛЛ, РСАЛ и РДТК.

Кумулятивные свойства Теобона-дитиомикоцида не проявились ни при введении вещества в желудок, ни при накожной аппликации. Животные в течение всего эксперимента не погибали, видимых признаков интоксикации у них не наблюдали. Внешний вид, поведение, потребление воды и корма было таким же, как и у контрольных животных. Интегральные показатели состояния организма (состав периферической крови, активность АЛТ, АСТ, ЩФ, ХЭ, содержание в сыворотке крови общего белка, холестерина, в моче — белка, хлоридов и др.) существенно не изменялись.

С целью установления особенности токсикодинамики Теобона-дитиомикоцида и определения пороговых доз при многократном воздействии были проведены эксперименты с многократным (60 дней) введением вещества в желудок и нанесением на кожу в дозах, близких к реальным. Крысам в желудок препарат вводили в течение 60 дней в дозах 0,4; 4,0 и 40,0 мг/кг. В динамике (15, 30 и 60 дней) исследовали состояние сердечно-сосудистой, дыхательной, центральной нервной системы, морфологический состав периферической крови, активность АЛТ и АСТ в сыворотке и гомогенатах печени и сердца, содержание в сыворотке общего белка и соотношение белковых фракций, содержание холестерина, фосфолипидов.

При воздействии Теобона-дитиомикоцида в дозе 0,4 мг/кг значения всех исследованных показателей во все сроки тестирования не были изменены.

В дозе 4,0 мг/кг препарат спустя 15 дней после начала эксперимента приводил к незначительному (на 30 %) снижению активности АСТ в сыворотке крови с нормализацией в последующие сроки исследования, а также повышению (на 37 %) содержания холестерина спустя 30 дней после начала воздействия с нормализацией к окончанию эксперимента. Остальные показатели не изменялись.

Введение Теобона-дитиомикоцида в дозе 40,0 мг/кг сопровождалось несущественным повышением СПП: на 15 % спустя 15 дней и на 19 % спустя 30 дней от начала эксперимента. К концу опыта значение СПП было таким же, как у интактных крыс. Следует отметить, что эти изменения не выходили за пределы физиологических колебаний. Отмечено также повышение (на 48 %) содержания холестерина через 1 мес от начала опыта, к окончанию эксперимента этот показатель находился в пределах физиологических колебаний. Остальные показатели не изменялись.

Полученные данные свидетельствуют, что дозы: 40,0 мг/кг — действующая; 4,0 мг/кг — пороговая; 0,4 мг/кг — недействующая.

Эксперимент по изучению токсикодинамики Теобона-дитиомикоцида при нанесении на кожу был поставлен с учетом специфики предполагаемого его применения в условиях клиники. Крысам в течение 2 мес наносили на кожу Теобон-дитиомикоцид в виде 5 % и 10 % водного раствора, а также в виде мази на ланолине, содержащей 10 % и 30 % действующего вещества. Контрольным животным на кожу наносили ланолин. Все животные остались живы, симптомов интоксикации у них не наблюдали, кожа на месте аппликации была обычного вида, без признаков раздражения, в дальнейшем равномерно покрывалась шерстью. Теобон-дитиомикоцид в виде 5 и 10 % растворов и 10 % мази не оказывал влияния на исследуемые показатели. Аппликации 30 % мази приводили к изменениям некоторых показателей (активности АСТ, содержания сульфгидрильных групп, СПП), которые могут быть расценены как пороговые (табл. 1, 2, 3, 4).

При патоморфологическом исследовании не обнаружили нарушений структуры внутренних органов у всех опытных крыс.

Гистологический анализ срезов кожи крыс с участков нанесения Теобона-дитиомикоцида выявил неизмененную структуру кожи в фазе телогена и аногена. Волосяные фолликулы имели обычную структуру и различались в зависимости от фаз циклов роста волоса. Повреждений эпителия волосяных фолликулов и структуры волоса не обнаружено, отсутствовал также такой характерный критерий повреждающего действия на кожу химических агентов, как инволюция волосяных фолликулов.

Многослойный эпителий эпидермиса также не был изменен. Отсутствовали утолщения рогового слоя, не отмечено компенсаторной гиперкератинизации.

Дерма, представленная пучками коллагеновых волокон, также не была повреждена, не содержала локальных инфильтратов как лейкоцитарными, так и лимфоидными клеточными элементами. Диффузная инфильтрация находилась в пределах показателей контрольных крыс. Жировые железы имели обычную структуру.

Таким образом,теобон-дитиомикоцида в исследуемых концентрациях не оказывал повреждающего действия на кожу белых крыс.

Тератогенного, гонадотоксического действия Теобон-дитиомикоцид не оказывал, репродуктивную функцию не нарушал.

Анализ результатов изучения эмбриотоксичности на мышах и крысах показал, что при воздействии препарата в период органогенеза у опытных животных обеих групп (40 мг/кг и 400 мг/кг) наблюдали единичные аномалии скелета, но такие же явления отмечены и у крыс контрольной группы. Статистических различий между опытом и контролем не было. В группе животных, получавших 400 мг/кг Теобона-дитиомикоцида, отмечали небольшое, но статистически достоверное, снижение массы тела плодов (в контроле 1,16 г, в опыте 0,96 г), что можно расценивать как следствие эмбриотоксического действия. По остальным исследованным показателям разницы между опытом и контролем не было. Потомство, полученное от опытных животных и наблюдавшееся до полуторамесячного возраста, по показателям соотношения полов, прироста массы тела, результатам биохимических исследований не отличалось от плодов контрольных животных.

Мутагенное действие у Теобона-дитиомикоцида не проявилось.

Инициирующая бластомогенная активность препарата не выявлена. Об этом свидетельствовало отсутствие повреждений ДНК в клетках печени, почек, желудка, селезенки, щитовидной железы и костного мозга крыс и мышей через 24 ч после введения в желудок Теобона-дитиомикоцида в максимально переносимой дозе.

Канцерогенная активность Теобона-дитиомикоцида у крыс на модели "НДЕА-гепатэктомии" также не была выявлена. Воздействие препарата осуществляли на фоне инъекции N-нитрозодиэтиламина и частичной гепатэктомии. Все опытные и контрольные животные дожили до окончания эксперимента и были умерщвлены под эфирным наркозом, после чего у них отобраны образцы органов и тканей для обзорных гистологических исследований, печени — также для гистоэнзимологического определения гаммаглютамил-транспептидазы, как маркерного фермента пренеопластических повреждений печени. Обзорные гистологические исследования не выявили предопухолевых и опухолевых изменений ни в одном из проанализированных образцов, кроме печени. Микроструктурно в тканях паренхиматозных органов (печень, почки) опытных животных обнаружены гемодинамические (полнокровие сосудов и капилляров стромы, локальные геморрагии) и деструктивно-дистрофические изменения, сопоставимые с таковыми у контрольных животных. Выявленные в обзорно-гистологических и гистохимических исследованиях гиперпластические гамма-глютамилтранспептидаза, положительные узелки в печени опытных животных по частоте встречаемости не превышали контрольных показателей, количество гиперпластических узелков на см2 площади среза печени сопоставимо с контролем (в опыте 39,4±6,1, в контроле 39,0±5,6), средняя площадь узелков одинакова у подопытных и контрольных крыс (0,9±0,2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что Теобон-дитиомикоцид не оказывает промоторного эффекта на инициированных гепатоцитах.

При изучении канцерогенной активности Теобона-дитиомикоцида (200 мг/кг) с помощью мультиорганной модели наиболее часто у всех животных (опытных и контрольных) определяли следующие предопухолевые состояния: узелковая гиперплазия в печени и гиперплазия бронхогенного эпителия. Узелковая гиперплазия обнаружена в печени в 35 % случаев у контрольных животных и в 33 % у опытных. Гиперплазия бронхогенного эпителия выявлена в 47 % случаев у контрольных животных и в 13 % у опытных. Это можно объяснить последовательным действием нескольких канцерогенов (нитрозодиэтиламин — НДЕА, нитрозометилмочевина — НМИ, нитрозодибутиламин — НДБА), органами — мишенями для которых являются печень (для всех трех) и легкие (для последних двух). Тем не менее, опухолей печени и легких в этом эксперименте не выявлено.

Одинаково часто у контрольных и опытных животных диагностированы папилломатозные разрастания пищевода и преджелудка, состоящие из тяжей соединительной ткани, окруженные эпителием с хорошо дифференцированными слоями клеток от базального до ороговевающих, с признаками гиперкератоза. Выявлено 2 случая аденоматоза в желудке. У одного животного диагностирован тубулярный атипичный аденоматоз железистой части желудка с множеством митозов в эпителиальных клетках, у другого обнаружен микроочаг аденоматоза дивертикулярного типа. Из предопухолевых состояний выявлены микроочаги эндофитного роста железистого эпителия.

В щитовидной железе как опытных, так и контрольных крыс наблюдали случаи умеренной гиперплазии. Микроскопически щитовидная железа имеет мелкие и среднего размера фолликулы, выстланные кубическим и цилиндрическим эпителием со светлой цитоплазмой и богатыми хроматином ядрами, расположенными в базальной части клетки.

Анализ представленных данных позволяет заключить, что воздействие Теобона-дитиомикоцида не приводит к увеличению частоты предопухолевых и опухолевых изменений ни в одном из исследованных органов, а также не вызывает развития процессов, не встречающихся у контрольных крыс.

Результаты морфометрических измерений гиперпластических узелков в печени крыс показали, что частота встречаемости их у опытных крыс не превышала контрольных показателей, количество узелков на см2 площади среза печени было сопоставимо с контролем, средняя площадь узелков у опытных и контрольных крыс была одинаковой. Таким образом, Теобон-дитиомикоцид в условиях данного эксперимента не проявлял промоторного эффекта на инициированных комплексом канцерогенов клетках разных органов.

Следовательно, Теобон-дитиомикоцид в виде 5 % и 10 % водных растворов и 10 % мази на основе ланолина может быть использован в процессе клинических испытаний.

Литература
1. Лечение микозов в условиях Западной Сибири. Лыкова С.Г., Позднякова О.Н. // Тези доповідей VII Укр. з'їзду дерматовенерологів. —Київ, 1999. —С. 26.
2. Гайдучок І.Г. До питання епідеміології дерматомікозів. // Тези доповідей VII Укр. з'їзду дерматовенерологів. —Київ, 1999. —С. 22.
3. Рукавишникова А.И., Суколин Г.Н., Куклин В.Т. Лечение и профилактика микозов стоп. —Казань, 1994. —128 с.
4. Методические рекомендации по представлению документации на лекарственные средства в Фармакологический комитет Министерства здравоохранения Украины. —К.: МЗ Украины, Фармакологический комитет, 1993. —35 с.
5. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP) /Руководящий нормативный документ. —М., 1992. —78 с.
6. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения эффективной дозы и ее ошибки. // Фармакол. и токсикол. —1978. —№ 2 —С. 497-512.
7. Кундиев Ю.И. Всасывание пестицидов через кожу и профилактика отравлений. —Киев: Здоровье, 1975. —199 с.
8. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. -Киев. 1988. —207 с. 9. Каган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. —Киев: Здоровье, 1981, —174 с.
10. Алексеева О.Г., Петкевич А.И. К методике определения аллергенных свойств химических веществ // Гигиена и санитария. —1973. —№3. —С. 64-67.
11. Корбакова А.И., Уланова И.П. Методы исследования функции нервной системы. // Методы определения токсичности и опасности химических веществ. —М.: Медицина, 1970. —С. 163-166.
12. Розин М.И. Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований. —Л.: Медицина, 1954. —189 с.
13. Биохимические, иммунологические и биофизические методы в токсикологическом эксперименте / Метод. руководство. —Киев, 1989. —184 с.
14. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. —М.: Медицина, 1987. —175 с.
15. Финагин Л.К. Обмен холестерина и его регуляции. Киев.: Вища школа, 1980. —168 с.
16. Cochin J., Axelrod J. Biochemical and Pharmacological changes in the Rat followig chronik administration of Morphin, Nalomorphin and Nomorphine // J. Pharmacol. Exp. Ther., 1959, № 2. —Р. 105-109.
17. Гацко Г.Г., Мажуль М.М., Поздняков Е.А. Перекисное окисление липидов в тканях крыс разного возраста в норме и при голодании // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1982. —№ 2. —С. 30-32.
18. Стальная И.Д., Гаршивили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. —М.: Медицина, 1977. —С. 66-68.
19. Бабенко О.Г. Визначення мікроелементів і металоферментів у клінічних лабораторіях. —К.: Здоров`я, 1968. —101 c.
20. Elman J. Tissue sulphydryl groups // Arch. Biochem. and Biophys. -1959. —V 82. —Р. 70-77.
21. Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию. —М.: МЗ СССР, 1985. —31 с.
22. Mechanisms of Carcinogenesis in Risk Jdentification. —Lyon: Jnternational Agency for researeh on Cancer. —1992. —615 p.
23. Kohn R.W., Erickson R.A. and Friedman C.A. Fractionation of DNA from mammalion cells by alkaline elution // Biochemistry, —1976. —V 15. —Р. 4629-4637.
24. Parodi S., Taningher M., Sant L. A practical procedure for testing DNA damade in vivo proposed for a prescreening of chemical carcinogenes // Mutat. Res. —1978. —54, № 1. —Р. 39-46.
25. Jto N., Shirai T., Hasegawa R. Mediumterm experiment for carcinogenes in risk identification / Ed. H. Vainio, P.N. Magel, D.B. McGregor, A.J. Mcmichael. —Lyon. International Agency for research on Cancer, 1992. —Р. 353-388.
26. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. —М.: Медицина, 1990. —224 с.


| Содержание |