|
ТОКСИНЫ МИКРООРГАНИЗМОВ УДК 582.288-11+577.18 МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ТРИХОТЕЦЕНОВЫЕ МИКОТОКСИНЫ: ПРОДУЦЕНТЫ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ, ФИЗИОЛОГИЯ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ, ТОКСИГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ (обзор литературы) Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев Последние десятилетия характеризуются усиленным вниманием к вопросам охраны окружающей среды. В этой глобальной проблеме немаловажное место отводится микотоксинам, которые представляют реальную опасность для здоровья человека, обусловленную повсеместным распространением в природе, а также высокой физиологической активностью, весьма ощутимым экономическим ущербом, который они наносят народному хозяйству. Особое место среди многочисленного семейства микотоксинов занимают так называемые трихотеценовые микотоксины, которые объединяют группу структурно близкородственных вторичных метаболитов, образуемых различными видами несовершенных грибов. Характерная особенность веществ этого семейства (а это почти треть всех известных микотоксинов) состоит в том, что они являются производными трициклической системы, получившей наименование трихотекана — от названия первого представителя этой группы трихотецина, выделенного Фрименом и Моррисом [10] из Trichothecium roseum. Как видно из рис. 1, в трихотекановой группировке в положении "9, 10" представлена олефиновая связь, а в положении "12, 13",- эпоксигруппа, с которыми связывают биологическую активность веществ этого класса. Исключение составляет веррукарин К, у которого "12, 13" — эпоксигруппа отсутствует [11]. Исходя из особенностей химического строения все трихотеценовые микотоксины можно разделить на две большие группы — спирты и эфиры. К последним относят также макроциклические ди- и триэфиры, которые представлены главным образом веррукаринами и роридинами, получившими название от видов рода Myrothecium (M. verrucaria и M. roridum), которые являются их основными продуцентами. Именно этой группе трихотеценовых микотоксинов посвящается настоящий обзор. Структура и свойства макроциклических трихотеценов Все макроциклические триэфиры объединяют в ряд веррукаринов, а диэфиры — в ряд роридинов. С27 — веррукарины и С29 — роридины различаются заместителями в С6`-положении (карбонильная группа у первых и гидроксиэтильная — у вторых). В пределах класса роридинов выделяют еще несколько подклассов: сатратоксины, вертиспорины, бакхарины, роритоксины, митоксины и др. Все они имеют в макролидной цепи тетрагидропирановое кольцо, а бакхариноиды — оксигенированное А-кольцо. Вполне вероятно, что многие из совсем недавно открытых трихотеценов, таких как триховеррины, триховерролы и триходермадиены, которые имеют разрыв в макролидной цепи, могут рассматриваться в качестве промежуточных веществ в путях биосинтеза макроциклических трихотеценов (МЦТЦ) [20]. Все известные в настоящее время МЦТЦ (более 60 веществ) являются эфирами трихотеценового спирта веррукарола, и это, пожалуй, единственное общее их свойство. Химические же различия МЦТЦ сводятся главным образом к различиям заместителей в положении "4, 15". Структуры некоторых наиболее характерных представителей трихотеценовых микотоксинов приведены на рисунке. Структура МЦТЦ впервые была установлена при помощи X-ray дифракционного анализа р-иодбензоата веррукарина А [25]. Впоследствии сообщалось о структуре различных МЦТЦ: веррукарина В, роридина А, изороридина Е, миротоксинов В и С. Все МЦТЦ являются бесцветными, кристаллическими, оптически активными соединениями, растворимыми в умеренно полярных растворителях и очень слабо в воде. Для них характерна очень высокая стабильность. По сравнению с простыми трихотеценами, МЦТЦ являются значительно более окисленными соединениями, что особенно характерно для бакхариноидов. Методы анализа Разработка методов обнаружения и количественного определения трихотеценов как в культурах грибов, так и в естественно инфицированных субстратах является исключительно актуальной с точки зрения их потенциальной опасности для человека и животных. В настоящее время в реализации этой проблемы выделяют несколько подходов, преимущества и недостатки которых были рассмотрены в работах [10, 39]. Хотя многие физические методы количественного определения трихотеценовых микотоксинов хорошо применимы к очищенным образцам, использование их для анализа неочищенных экстрактов из грибных культур, кормовых и пищевых субстратов во многих случаях остается весьма проблематичным из-за необходимости дополнительной очистки от веществ белковой и липидной природы, пигментов и т. п. Так, Stahr et al. [33] выделяют следующие основные этапы в анализе трихотеценов: экстракция органическим растворителем (хлороформ, метиленхлорид, ацетон, ацетонитрил и др.), осаждение белков уксуснокислым свинцом, обезжиривание (н-гексан, н-гептан, петролейный эфир и др.), депигментация (активированный уголь, окись алюминия, жидкость-жидкостное перераспределение) и концентрирование (обычно упаривание при сниженном давлении). Газовая хроматография с успехом может быть использована для анализа простых трихотеценов. Несмотря на то, что этот метод весьма трудоемок из-за необходимости получения летучих производных микотоксинов, он характеризуется исключительно высокой чувствительностью, которая достигается путем использования различных типов детекторов. Так, использование детектора, основанного на принципе электронного захвата, позволяет повысить чувствительность метода в 3-50 раз, по сравнению с использованием пламенно-ионизационного детектора, а минимальные уровни обнаружения для различных трихотеценов составляют от 2 мкг/кг (2 ppb) до 80 мкг/кг [21]. Очень высокое разрешение было характерным также для газового хроматографа, оснащенного стеклянной капиллярной колонкой, разработанной Szathmary et al. [34]. В отдельных случаях для детекции трихотеценов используют комбинацию газовой хроматографии и масс-спектрометрии, что позволяет обнаруживать уровни Т-2 токсина и дезоксиниваленола ниже 50 ppb [27].Кроме того, этот метод позволяет осуществлять идентификацию трихотеценовых микотоксинов. В последние годы во многих лабораториях для анализа трихотеценов используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), позволяющий разделять и идентифицировать сложные смеси трихотеценовых и других микотоксинов [16]. Границы обнаружения этого метода на уровне 1 мкг/на инъекцию образца и достигается она за счет использования в качестве детектора дифференциального рефрактометра [32]. Основным преимуществом ВЭЖХ перед газовой хроматографией является то, что отпадает необходимость получения летучих производных. Однако, ВЭЖХ предъявляет высокие требования к предварительной очистке образцов и компонентов жидкой фазы. Тонкослойная хроматография (ТСХ) хотя и уступает по чувствительности газовой и жидкостной хроматографии, все же позволяет обнаруживать трихотецены на уровне нескольких десятков нанограммов. Преодоление этого недостатка за счет разработки различных типов денситометров, в частности флюороденситометра [31], с учетом простоты и низкой стоимости, делает его незаменимым для массового анализа образцов. Биологические методы анализа, в которых используются различные тест-системы (микроорганизмы, простейшие, ракообразные, зеленые водоросли, культура клеток, кожная проба на кролике и многие другие), не отличаются высокой специфичностью и более пригодны для скрининговых работ. Преимущества и недостатки биологических методов анализа микотоксинов детально обсуждаются в ряде публикаций [6, 23]. В то же время следует акцентировать внимание на высокой эффективности и надежности использования комбинации микробиологического метода и ТСХ, так называемого метода биоавтографии [3]. В последние годы для трихотеценовых микотоксинов разработаны иммунохимические методы анализа, в основе которых лежит получение антител к сложным конъюгатам трихотеценовых микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Получаемые при иммунизации кроликов антитела оказались строго специфичными и высокочувствительными к Т?2 токсину [13] и роридину А [17]. Однако, методы иммунохимического анализа трихотеценов оказались полезным инструментом для обнаружения только одного специфического микотоксина и малопригодными для скрининга трихотеценов вообще. К недостаткам метода следует отнести также его высокую стоимость. Грибы-продуценты и их распространение Многочисленное семейство трихотеценовых микотоксинов образуется сравнительно небольшим числом грибных родов. Так, большинство простых трихотеценов синтезируется представителями рода Fusarium. Образование лишь немногих из них характерно для видов Trichothecium (трихотецин и трихотеколон), Trichoderma (триходермин и триходермол), Cephalosporium (кротоцин и кротокол), Calonectria (калонектрины). Грибы-продуценты простых трихотеценов в настоящее время обстоятельно изучены, и сведения о них обобщены в ряде обзоров и монографий [9, 10, 28]. В значительно меньшей степени изучены продуценты МЦТЦ. Известные на сегодняшний день вещества этого класса образуются видами Myrothecium Tode. ex Fries, главным образом M. verrucaria (Albert. et Schwein) Ditmark ex Fries и M. roridum [19] Tode ex Steudel, M. leucotrichum (Feck) Tulloch [20], Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai [2], Stachybotrys atra Corda [20], Verticimonosporium diffractum [26], Cylindrocarpon sp. [24], Phomopsis leptostromiformis [30], Cryptomela acutispora [38]. До недавнего времени образование МЦТЦ ограничивалось перечисленными грибными видами. Однако, американским исследователям [22] при скрининге веществ, обладающих антилейкемическим действием, из бразильского кустарника Baccharis megapotamica Spreng (Asteracea) удалось выделить и изучить структуру нового вещества, относящегося к этому классу природных соединений и получившего название бакхарина. Бакхарин, по сути, оказался первым из известных трихотеценов, выделенным из высших растений. Впоследствии [12] из этого растения, а также B. coridifolia было выделено семейство бакхариноидов и других родственных метаболитов трихотеценового ряда. Микроскопические грибы, образующие МЦТЦ, широко распространенны в природе и представлены как строго сапрофитными, так и патогенными видами. Так, виды Myrothecium встречаются на растениях более, чем 20 семейств. Их обнаруживают на семенах хлопчатника, ячменя, овса, пшеницы, риса, различных бобов, томатах, перце, цветочных растениях, табаке, саженцах, на листьях растений смешанных пастбищ и т. п. Сведения о распространенности видов Myrothecium на различных растениях обобщены в работах [14, 35]. Грибы рода Myrothecium, как правило, обнаруживаются в почвенных образцах и на разлагающихся растительных остатках [29]. D. toxicum поселяется преимущественно на грубых кормах, сене, соломе и других растительных субстратах. Обнаруживается он также на волокнах хлопка, в ризосфере кенафа, на болотно-подзолистых почвах, в почвах под хлопчатником, в ризосфере кормовых культур, на корнях сельскохозяйственных растений, в почве и т. п. К большинству перечисленных субстратов приурочены также виды Stachybotrys. С более обстоятельной информацией относительно распространенности видов Dendrodochium и Stachybotrys можно ознакомится в работах [1,4]. Сведения относительно распространенности токсигенных видов Verticimonosporium и Cylindrocarpon в доступной нам литературе отсутствуют. Приуроченность продуцентов МЦТЦ к различным растительным субстратам многие исследователи [1] связывают с их высокой целлюлозолитической активностью. Дифференциация видов внутри родов грибов, образующих МЦТЦ, с нашей точки зрения, представляется весьма сложной задачей даже для опытных таксономистов, поэтому в оригинальных работах видовая принадлежность исследуемых штаммов часто остается неизвестной. Согласно классификации Tulloch [37], род Myrothecium в настоящее время насчитывает 12 видов, в том числе M. verrucaria, который ранее оспаривался некоторыми исследователями. В то же время она считает, что этот вид является синонимом D. toxicum Pidopl. et Bilai [4], не приводя при этом достаточной экспериментальной аргументации. Не менее сложной представляется также видовая дифференциация Stachybotrys [1] и других грибов, образующих МЦТЦ. Физиология токсинообразования Данные литературы относительно физиологии образования трихотеценов весьма немногочисленны и зачастую противоречивы. Более изученными в этом плане грибы, образующие простые трихотецены, о чем свидетельствует довольно обстоятельная сводка, имеющаяся в монографии [1]. Что касается физиологии образования МЦТЦ, то приходится с сожалением констатировать полное отсутствие специальных исследований по физиологии биосинтеза конкретных веществ этой группы. В некоторой степени восполняют этот пробел широкие исследования по физиологии токсигенных штаммов, выполненные отечественными учеными, поскольку открывают подходы к более углубленному и целенаправленному изучению биосинтеза МЦТЦ. Было показано [1], что D. toxicum образует токсические вещества как при инфицировании природных субстратов, так и при культивировании в лабораторных условиях на синтетических средах. Микотоксины образуются в мицелии и культуральной жидкости при поверхностном и глубинном способах культивирования гриба. Наиболее активный синтез токсических метаболитов имеет место на средах с сахарозой, крахмалом, мальтозой, глюкозой, фруктозой, глицерином, а хороший рост гриба на отдельных углеродных субстратах не всегда коррелирует с его токсинообразованием. Однако, высокая антибиотическая активность выделенных препаратов в отношении дрожжевой тест-культуры, а также их высокая токсичность для лабораторных животных отмечалась только при культивировании гриба на средах с глюкозой. Высокая активность токсинообразования наблюдалась при использовании в качестве источников азота аммония азотнокислого и фосфорнокислого, а ее ингибирование, наряду с ингибированием роста, отмечалось на средах с хлористым, углекислым и щавелевокислым аммонием. При использовании аминокислот в качестве единственного источника азотного питания было установлено активирование роста гриба в присутствии глутаминовой кислоты, b-аланина, b-фенил-a-аланина, а его токсинообразующая способность усиливалась добавлением в среду b-аланина, глутаминовой кислоты, лейцина, лизина, орнитина [1]. Изучение физиологии токсинообразования у видов Stachybotrys связано главным образом с работами [5], и [1], показавшими, что максимальный синтез токсинов отмечался на средах, в которых в качестве источника углерода использовали арабинозу, галактозу, крахмал, глюкозу, сахарозу, а в качестве источника азота — глицин, аланин, триптофан, лейцин, аспарагин. Введение в среду повышенных концентраций глюкозы, а также витаминов В1, С и, особенно, никотиновой кислоты способствовало существенному усилению роста и токсинообразования S. alternans [1]. Штаммы S. alternans, выделенные из природных целлюлозосодержащих субстратов, проявляли хороший рост на соломе различных злаковых культур, стеблях льна, конопли, джута, коробочках хлопчатника [1,5], Eppley и Bailey [15] с успехом культивировали S. atra на овсе, а Harrach et al. [18] — на соломе. Физиология токсинообразования видов Myrothecium не была предметом специального изучения, а большинство работ, касающихся наработки, выделения и установления химической природы отдельных трихотеценов, выполнено в химических лабораториях. Тем не менее, анализ этих работ свидетельствует о преимущественном использовании среды Чапека-Докса в различных модификациях, состоящих главным образом во введении сложных растительных и животных вытяжек типа пептона, дрожжевого и солодового экстракта [36, 41]. В отдельных случаях использовали синтетические среды [19]. В качестве основного источника углерода, как правило, используется глюкоза, а в качестве источников азотного питания — азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, хлористый аммоний. При этом необходимо отметить, что концентрации источников углеродного и азотного питания в среде варьировали в довольно широких пределах, однако проследить зависимость токсинообразования не представлялось возможным, вследствие существенных различий других культуральных условий (использование различных штаммов, различных типов и объемов ферментеров, времени культивирования, введение различных добавок). Во всех случаях для приготовления сред использовали деминерализованную воду, в связи с чем обращает на себя внимание отсутствие каких-либо сведений относительно роли отдельных микроэлементов в процессах токсинообразования, хотя некоторые исследователи [19, 36] и вводили в состав среды ионы цинка и железа. Нами при изучении физиологии биосинтеза МЦТЦ у D. toxicum было показано значительное увеличение синтеза веррукаринов и роридинов при добавлении в среду ионов цинка. При этом активные концентрации этого элемента для стимуляции роста гриба и синтеза микотоксинов были различными. Эффект цинка равнозначно можно было заменить внесением ионов марганца в тех же концентрациях. Микотоксинстимулирующее действие было отмечено также при внесении ионов бора и кальция, в то время как ионы молибдена, кобальта и меди проявляли ингибирующее действие. Изучение роли отдельных микроэлементов в процессах синтеза микотоксинов приобретает особое значение в связи с контаминацией токсинобразующими грибами комбикормов и их реакцией на наличие премиксов, содержащих различные микроэлементы. Обстоятельное изучение этого вопроса создает предпосылки регуляции микрофлоры как кормовых, так и пищевых субстратов. Большинство штаммов грибов, образующих МЦТЦ, выращивают в течение 2-5, иногда — 7-10 сут [1, 19] в условиях глубинного культивирования. В условиях стационарного культивирования на жидких средах или при культивировании на твердых природных субстратах эти сроки, как правило, удлиняются до 10-60 сут [1, 15] и могут существенно варьировать в зависимости от конкретных штаммов и других условий культивирования. Штаммы грибов, образующих МЦТЦ, хорошо растут в широком диапазоне температур, однако, максимум как роста, так и токсинообразования характерен для температур порядка 25-27 °С. Так, температурный оптимум роста S.alternans составлял 20-25 °С, в то время как температурные границы роста лежали в пределах 2-39 °С [1]. Большинство штаммов Myrothecium, лучший рост и токсинообразование проявляли при температуре 27 °С, [19] хотя некоторые исследователи [14] с успехом культивировали их при температуре 20 °С. Оптимальная температура для роста штаммов Dendrodochium около 25 °С, хотя довольно интенсивный рост отмечается при 7-35 °С [1]. За немногим исключением, специальных исследований относительно влияния pH на токcинообразование штаммов, образующих МЦТЦ, не проводилось. Так, в работе [19] вообще не отмечают pH среды ни для одного из 4-х изученных авторами штаммов Myrothecium. С другой стороны, было показано [7], что M. Verrucaria BКМ-183, характеризующийся высокой фитотоксической активностью, проявлял хороший рост в границах pH от 3,0 до 7,0 с оптимумом при pH 4,5-5,5, в то время как максимальная фитотоксическая активность отмечалась при pH 4,5-5,0. Хороший рост и токсинообразование D. toxicum наблюдается при pH 5,2-5,8, однако к концу 4-х сут глубинного культивирования уровень pH повышался до 6,8-7,3 [1]. Анализ представленных выше работ указывает на то, что способность синтезировать МЦТЦ в значительной степени варьирует у различных штаммов и определяется пригодностью источников углеродного и азотного питания, других ростовых факторов, продолжительности и способа культивирования и т. п. В свете изложенного, физиологическая направленность и эффективность процессов биосинтеза МЦТЦ является исключительно важной не только в разрезе их понимания. Она позволяет, исходя из реальной ситуации, оценить потенциальную опасность контаминации грибами различных субстратов, а также разработать эффективные профилактические мероприятия. О характерной особенности продуцентов МЦТЦ синтезировать семейства микотоксинов сообщалось ранее [6]. Токсигенный потенциал Несмотря на повсеместное распространение грибов, образующих МЦТЦ, сведения относительно их токсигенного потенциала весьма ограничены, поскольку такие исследования большей частью проводили на единичных штаммах. Нами был изучен токсигенный потенциал 68 штаммов грибов, культивируемых на просе. В работе использовали культуры грибов, выделенных из почвы, ризосферы сельскохозяйственных растений, различных растительных субстратов, а также ряд коллекционных штаммов. Исследуемые культуры распределяли по видам следующим образом: D. toxicum (39 шт.), M. verrucaria (10 шт.), M. roridum (6 шт.), M.cinctum (4 шт.), S .alternans (4 шт.), S. atra (5 шт.). Наряду с изучением компонентного состава МЦТЦ при помощи ВЭЖХ, исследовали также ряд других свойств: токсичность (кожная проба), антибиотическую активность в отношении дрожжевой тест-культуры, морфолого-культуральные особенности грибов и т. п. [40] В таблице в обобщенном виде представлены лишь некоторые данные этих исследований. Работа же в целом позволяет сделать следующие выводы: Обнаруженная нами способность изученных штаммов M.cinctum синтезировать МЦТЦ кажется очень интересной, поскольку проведенные ранее работы на представителях этого вида не выявили МЦТЦ, хотя в биопробах эти штаммы оказались токсичными [8]. Связь физиологической активности трихотеценовых микотоксинов с наличием в их структуре 12,13-эпоксигруппы, а также олефиновой связи в положении "9, 10" предполагает сходный спектр биологических эффектов этих веществ. Однако, в действительности имеет место более пестрая картина, особенно характерная для МЦТЦ, и заслуживающая отдельного рассмотрения. Литература |