УДК 615.3:616.94

ВЛИЯНИЕ СИЛИБОРА В КОМБИНАЦИИ С АЦЕТАТОМ a-ТОКОФЕРОЛА НА ТОКСИКОКИНЕТИКУ ДИНИТРООРТОКРЕЗОЛА В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

В.Д. Лукьянчук, д.м.н., проф., Д.С. Кравец

Луганский государственный медицинский университет

Одной из насущных проблем современной экологической фармакологии, промышленной и сельскохозяйственной токсикологии является изучение, лечение и предупреждение патологических состояний, вызванных воздействием на организм ксенобиотиков различной химической структуры. Среди органических соединений, наиболее широко используемых в промышленности и сельском хозяйстве, важное место занимают алкилпроизводные 2,4-динитрофенола, в частности динитроортокрезол (ДНОК), который отличается весьма высокой токсичностью и опасностью для лиц, контактирующих с ним как в условиях производства, так и применения в различных отраслях народного хозяйства, в том числе и в аграрном секторе в качестве пестицидного препарата.

При нарушениях технологии синтеза, техники безопасности, а также при катастрофах техногенного характера возникают как острые, так и хронические отравления ДНОК, нередко приводящие к летальному исходу работающих. В настоящее время лечение отравлений этими ксенобиотиком сводится, как правило, к использованию лишь общепринятых дезинтоксикационных мероприятий и применению средств симптоматической терапии. Причиной этого является отсутствие в арсенале практических врачей высокоэффективных и доступных средств лечения и лекарственной профилактики острых и хронических отравлений этим соединением.

Ранее нами [1] было показано, что профилактическое применение силибора в комбинации с a-токоферолом в значительной степени снижает токсические проявления острого перорального отравления ДНОК, что и послужило основанием для экспериментального изучения влияния комбинации силибора с a-токоферолом на характер токсикокинетики этого ксенобиотика.

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на белых нелинейных крысах, а также крысах линии Вистар обоего пола, массой 160-220 г. Экспериментальной моделью служил патологический процесс, развивающийся у животных при внутрижелудочном введении ДНОК в среднесмертельной дозе (ЛД₅₀=50 мг/кг). Животные были разделены на 2 группы: первая (контрольная), крысам вводили только ДНОК, второй — вводили: силибор в дозе 140,65 мг/кг, в комбинации с a-токоферолом — 21,52 мг/кг за 70 мин до начала поступления яда в организм [1].

Исследовали процессы абсорбции, биотранспорта, распределения по органам и тканям и экскреции ДНОК с желчью и мочой.

Концентрацию пестицида в крови определяли в динамике — через 1, 3, 6, 12, 24, 72 и 108 чac от момента введения яда в организм. Хемобиокинетические показатели, в т.ч. и параметры обратимого комплексообразования, вычисляли с помощью разработанных нами компьютерных программ для ЭВМ на базе процессора Intel Pentium II-450 в рамках одночастевой и двухчастевой модели со всасыванием с помощью стандартных методов их расчета.

С целью более корректного суждения о влиянии изучаемых средств профилактики ДНОК-интоксикации на процессы биотранспорта яда сывороточными белками, нами был введен показатель индекса повышения сродства (ИПС), который вычисляется как отношение константы ассоциации сыворотки интактных животных к лиганду к таковой на фоне предварительного введения изучаемых препаратов:

ИПС = К_{асс. интактных}/К_{асс. преп.}

Концентрацию ДНОК в крови и моче определяли с помощью спектрофотометрического метода [2], в печени, почках, легких, сердце, мышечной ткани — по разработанному нами методу [3]. Полученные данные обрабатывали статистически при помощи критерия t Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Важным этапом токсикокинетики является процесс абсорбции ДНОК в кровь, от которого во многом зависит скорость возникновения и степень развития токсических эффектов.

В связи с этим представляло интерес в первую очередь изучить процессы всасывания изучаемого ксенобиотика в системный кровоток. Результаты этих исследований представлены в табл. 1, из которой видно, что ДНОК при внутрижелудочном введении крысам обладает высокой (87,41±5,46 %) степенью биодоступности, которая и объясняет довольно низкую величину среднесмертельной дозы.

Период полуабсорбции у ДНОК сравнительно невелик, что свидетельствует о его быстром поступании в системный кровоток. Это обстоятельство обусловливает весьма непродолжительный латентный период при острой интоксикации этим ядом и быстрое наступление токсического эффекта. С периодом полуабсорбции обратно пропорциональной зависимостью тесно связана константа скорости абсорбции, которая имеет довольно высокое значение (1,77±0,31), что может быть объяснено быстрым поступлением ДНОК в организм и развитием (в токсических) эффектов.

Установленное высокое значение максимальной концентрации ДНОК в крови и быстрое ее достижение (t_max=3 ч) обусловлено высокой степенью биодоступности и константой скорости абсорбции.

На фоне предварительного введения изучаемой комбинации средств фармакопрофилактики процесс всасывания ДНОК изменяется — биодоступность яда снижается на 18,3 %, а период полуабсорбции увеличивается на 35,0 %, что способствует уменьшению токсического действия яда посредством снижения тесно связанной с t_1/2,а величины константы скорости абсорбции, а это, в свою очередь, приводит к угнетению процессов всасывания ДНОК в кровь. Снижение показателя С_max ксенобиотика в крови свидетельствует о детоксикации пестицида под воздействием изучаемой комбинации биофлавоноида с антиоксидантом.

Следовательно, применение комбинации изучаемых средств детоксикации организма существенно модифицирует параметры, характеризующие процесс всасывания ДНОК при его внутрижелудочном введении. Так, константа скорости абсорбции уменьшается в 1,5, максимальная концентрация этого ксенобиотика снижается 1,75 раза, однако время ее достижения не изменяется и составляет 3 ч; период полуабсорбции при этом увеличивается также в 1,5 раза. Уменьшение биодоступности на 10 % обусловлено снижением абсорбции этого соединения.

Таким образом, комбинированное применение силибора с ацетатом a-токоферола уже на первом этапе прохождения ДНОК в организм — всасывания — оказывает положительное действие — снижает скорость и количество яда поступившего в системный кровоток.

Важным звеном токсикокинетики химических соединений в плане реализации их токсических эффектов является обратимое комплексообразование с белками сыворотки крови. В процессе переноса кровью большинство низкомолекулярных соединений, обладающих физиологической активностью, образует обратимые комплексы с белками плазмы. Обратимое связывание ксенобиотиков с этими компонентами крови является основной формой реализации ее транспортной функции. Наиболее универсальными комплексообразующими свойствами отличается сывороточный альбумин, молекулы которого способны обратимо фиксировать вещества самого различного химического строения, в т.ч. и ДНОК [4].

Изучение и направленное использование естественных защитно-адаптационных механизмов, включая обратимое комплексообразование ксенобиотиков с транспортными белками, составляет рациональную основу поиска и создания средств профилактики и терапии отравлений.

Изучение количественных параметров взаимодействия токсических веществ с транспортными белками позволяет получить высокоинформативные сведения о характере распределения яда в организме и его накоплении в различных биосредах, скорости элиминации и экскреции, что, в свою очередь, дает возможность выяснить вклад отдельных факторов, влияющих на токсичность ксенобиотиков, в том числе и ДНОК.

Известно [5], что наличие как полярных (нитрогруппы), так и гидрофобных (алкильные радикалы) заместителей в молекулах динитрофенолов различной химической структуры должно приводить к существенным различиям в комплексообразовании данных соединений по сравнению с фенолом, который с весьма высокой степенью аффинитета связывается с сывороточными белками [6, 7].

При изучении токсикокинетики ДНОК в процессе его биотранспорта кровью методом равновесного диализа установлено, что этот яд активно взаимодействует с белками сыворотки. Это в полной мере согласуется с ранее полученными данными [8]. На основании экспериментальных данных построены изотермы связывания (рис. 1) и графики в координатах Скетчарда (рис. 2).

На представленных изотермах связывания видно, что диализное равновесие в сыворотке крови наступает при значении CT равном 50•10^-5 моль как в сыворотке крови контрольных животных, так и в сыворотке крыс, которым предварительно вводили изучаемые лекарственые препараты. Как следует из рис.1, концентрация связанной фракции ДНОК с сывороткой крови контрольных животных соответствует практически таковой на фоне введения животным a-токоферола. Это свидетельствует о том, что данный антиоксидант практически не изменяет связывающую способность сывороточных протеинов.

Иная картина наблюдается при профилактическом введении силибора, когда увеличивается значение CT, что указывает на повышение емкостных характеристик транспортных белков. Применение комбинации a-токоферола с биофлавоноидом приводит к своего рода потенцированию комплексообразующей активности сывороточных белков.

С целью более корректного суждения о характере обратимого взаимодействия ДНОК с альбумином мы изучили (табл. 2, рис. 2) основные количественные показатели этого процесса — константу ассоциации обратимого комплекса [ксенобиотик+белок] (К_ас) и число мест связывания (n).

Установлено, что ДНОК с весьма высокой степенью аффинитета связывается с белками сыворотки крови (контроль). При этом Касс имеет довольно высокий порядок (10⁶). Комбинация изучаемых средств детоксикации увеличивает К_ас до 5,32•10⁶ при N, равном 23.

Увеличение К_ас и N может быть объяснено возможностью конформационной перестройки молекул протеинов сыворотки крови [7].

Установлено что, показатель ИПС в значительной степени (почти в 5 раз) увеличивается на фоне применения комбинации изучаемых средств (табл. 2). Это служит еще одним доказательством повышения связывающей способности сывороточных белков под воздействием комбинации исследуемых лекарственных препаратов.

Известно [6], что взаимодействие ксенобиотиков различного химического строения с белками сыворотки крови приводит к уменьшению их токсического влияния на организм в связи с тем, что в клетки проникает лишь свободная (не связанная с белками) фракция. Полученные нами данные свидетельствуют о целесообразности применения комбинации биофлавоноида силибора и антиоксиданта a-токоферола при ДНОК-интоксикации, так как эти препараты уже на этапе транспорта способствуют существенному снижению токсических воздействий яда на организм животных за счет увеличения сродства и емкости его связывания с сывороточными белками.

Результаты исследования токсикокинетики ДНОК (табл. 3) показывают, что пестицид в значительных концентрациях обнаруживается в крови в сравнительно короткий (3 час) период времени от начала исследования, что и обусловливает высокие уровни констант скоростей перехода. Однако, при введении средств комбинированной лекарственной профилактики кинетические параметры, характеризующие процесс пребывания яда в крови, претерпевают изменения. Так, снижается максимальная концентрация ДНОК, увеличивается объем распределения с одновременным сокращением среднего времени пребывания препарата в крови, что ведет к уменьшению поступления ксенобиотика в различные органы и ткани и снижению токсического воздействия на организм.

Под влиянием комбинации изучаемых средств (табл. 4, 5) ДНОК неравномерно поступает в изучаемые органы и ткани. Наиболее быстро — в почки, несколько медленнее — в печень и сердце, а в легкие и мышечную ткань этот ксенобиотик абсорбируется с наименьшей скоростью, о чем свидетельствуют константа скорости абсорбции и величина периода полуабсорбции. Однако, его наибольшая максимальная концентрация наблюдается в сердце и печени, что согласуется с данными [9] о преимущественном токсическом поражении именно этих органов. Время достижения максимальной концентрации в печени и сердце составляет 12 ч, а в остальных изучаемых органах и тканях — 6 ч, что может быть объяснено постепенным накоплением ДНОК в печени и сердце.

Нами установлено (табл. 6), что ДНОК довольно активно выводится с мочой и желчью. Однако выведение с мочой несколько преобладает, о чем свидетельствуют константы скорости экскреции пестицида.

Максимальная концентрация изучаемого яда быстрее (4,5 чac) достигается в желчи, чем в моче (18 чac), т.е. уже в первые после часы перорального введения пестицид начинает выделяться с желчью.

На фоне введения изучаемых средств комбинированной лекарственной профилактики почти в 2 раза увеличивается константа скорости экскреции с мочой и желчью при одновременном повышении максимальной концентрации в 3,3 и 2,1 раза в крови и моче, соответственно. Однако, время достижения С_max изменяется лишь в желчи (табл. 6).

Почечный клиренс, характеризующий скорость очистки организма от токсического агента, на фоне применения изучаемых средств лекарственной детоксикации увеличивается более чем в 3 раза.

Таким образом, используемая комбинация биофлавоноида и антиоксиданта способствует снижению концентрации ДНОК в крови, печени, почках, легких, сердце и мышечной ткани, одновременно увеличивая экскрецию с желчью и мочой.

Литература
1. Кравец Д.С. Розработка дозового режима комбинированного применения силибора с ацетатом a-токоферола при интоксикации динитроортокрезолом // Український медичний альманах. —1999. —Т. 4, № 2. —С. 73-75.
2. Буркацкая Е.Н. Лысина Г.Г., Карпенков В.Н. Ла6ораторная диагностика интоксикаций пестицидами. —М., 1978. —232 с.
3. Лукьянчук В.Д., Кравец Д.С. Метод определения динитроортокрезола в органах и тканях // Совр. пробл. токсикол. —1999. —№ 4. —С. 39-40.
4. А.И.Луйк, В.Д.Лукьянчук. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. —М.: Медицина, 1984. —224 с.
5. Лукьянчук В.Д. Молекулярные механизмы взаимодействия сывороточного альбумина с динитроортокрезолом // Вопр. Мед. химии. —1983. —№ 2. —С. 8-11.
6. Лукьянчук В.Д., Луйк А.И. Токсичность и сродство к альбумину пестицидов в процессе их биотрансформации // Журн. клин. и эксперим. медицины. —1983. Т. 23, —№ 1, —С. 33-37. 7. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д. Параметры взаимодействия нитрофенолов различного химического строения с альбумином и их токсичность // Вопр. мед. химии. —1982. —№ 3. —С. 48-50.
8. Лукьянчук В.Д. Молекулярные основы механизма токсического действия и разработка принципов детоксикации динитрофенольных соединений: Автореф. дисс. докт. мед. наук. —Киев, 1988. —42 с.
9. Сидоренко Е.Н. Отравление пестицидами. —Киев: Вища школа, 1978. —128 с.