|
ТОКСИНЫ МИКРООРГАНИЗМОВ УДК 582.288 МІКРОБІОЛОГІЧНА ІНАКТИВАЦІЯ Т-2 ТОКСИНУ О.П. Кобзиста, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України Однією з найбільш характерних властивостей мікотоксинів, і зокрема трихотеценових, є їх антимікробна дія. З огляду на досить високу токсичність цих метаболітів, здається малоймовірним їх практичне застосування як антибіотичних агентів (звичайно, якщо виключити можливість хімічної модифікації молекул). Все ж, ретельний аналіз раніше виконаних робіт [1-3, 6] засвідчує деякі інші аспекти можливого практичного використання цієї властивості, зокрема для індикації мікотоксинів в різних харчових, кормових і виробничих субстратах, як одного з засобів профілактики мікотоксикозів, які завдають значних збитків сільськогосподарському виробництву та здоров'ю людей. Розробка мікробіологічних методів, які і на сьогодні є перспективними і такими, що широко використовуються в інших сферах людської діяльності, стає можливою лише за умови наявності високочутливих і специфічних штамів мікроорганізмів. Селекцію ж таких культур можна провести при вивченні антибіотичних властивостей мікотоксинів щодо широкого загалу штамів з різних таксономічних груп. В таких дослідженнях можуть бути виявленні штами мікроорганізмів, стійкі до мікотоксинів, іншими словами, штами, які потенційно повинні мати здатність метаболізувати (або ж трансформувати) ці агенти, що, в свою чергу, може відкривати перспективу їх використання для розробки біологічних методів інактивації мікотоксинів в різних субстратах. Дослідженню саме цього аспекту проблеми і присвячена дана робота. При вивченні антифунгальних властивостей деяких мікотоксинів, і зокрема таких, які регламентовані в продуктах харчування та кормах для тварин, нами був встановлений факт залежного від мікотоксинів росту дріжджів. Такі штами були виявлені в незначній кількості і переважно в межах виду Debaryomyces polymorphus. Особливо показовою була залежність від Т-2 токсину у Deb. polymorphus 396, яка проявлялась у заростанні паперових дисків, імпрегнованих розчинами Т-2 токсину. Саме ця обставина і була відправним моментом в подальших дослідженнях. Матеріали та методи дослідження Deb. polymorphus 396 засівали в колби Ерленмейєра на 0,7 л, які містили 150 мл середовища Рідер [4]. Щільність засіву складала 1,8•106 клітин/мл. Т-2 токсин вносили в середовище з розрахунку 2 мг/150 мл. Культивування здійснювали на качалках (220 об/хв) протягом 96 год при температурі 25-26 °С. Всі досліди проводились в стерильних умовах. Приріст біомаси дріжджів і вміст Т-2 токсину в середовищі враховували в динаміці вирощування через кожні 12 год. Ідентифікацію Т-2 токсину та його метаболітів проводили за допомогою тонкошарової хроматографії на пластинах "Silufol UV 254" (Чехія) після екстракції з культуральних фільтратів етилацетатом. Візуалізацію цих речовин на пластинах здійснювали за допомогою 4р(нітробензил)піридину (2 % розчин в ацетоні) з наступною обробкою концентрованим розчином аміаку [13]. Поряд з цим, індикацію Т-2 токсину та його метаболітів проводили за допомогою мікробіологічного методу, в якому використовували селекціоновану нами дріжджову тест-культуру Candida kefyr 899 з чутливістю до Т-2 токсину 3 мкг/мл. Для розгонки мікотоксинів на хроматограмі використовували систему хлороформ : метанол у співвідношенні 9:1. Як еталонні зразки були задіяні Т-2 токсин, НТ-2 токсин і Т-2 тетраол фірми "Serva". Приріст біомаси враховували ваговим методом після висушування. Культура Deb. polymorphus була люб'язно надана в наше розпорядження ст. н. співробітником інституту С.С. Нагорною, за що ми їй щиро вдячні. Результати та їх обговорення Результати досліджень, представлені на рис. 1, свідчать про незначне збільшення біомаси та істотне зниження вмісту Т-2 токсину в середовищі, який на кінець 2 доби культивування виявляється в незначній кількості і практично зовсім не виявляється на 3 добу за допомогою як хроматографічного, так і мікробіологічного методів. Натомість, як видно зі схеми хроматограми, наведеної на рис. 2, в динаміці "споживання" Т-2 токсину в культуральних фільтратах, поряд з Т-2 токсином, виявляються також НТ-2 токсин, Т-2 тетраол та інші сполуки, що дають забарвлення з 4р(нітробензол)піридином. Поряд з цим, виявляються пігментні речовини, забарвлені в оранжевий колір. На рис. 3 представлені структури Т-2 токсину та його метаболітів, а також можлива схема їх перетворень. Для трихотеценових мікотоксинів, до яких належать ці сполуки, є характерною трициклічна структура, що одержала назву трихотекана (від Trichothecium roseum, з якого вона була вперше виділена). Крім цього, для трихотеценів характерна 12,13-епоксигрупа, завдяки якій розвивається забарвлення з 4р(нітробензил)піридином, та "9,10"-ненасичений зв'язок, з якими пов'язують біологічну активність речовин цього класу. Варіації в активності окремих трихотеценів залежать від замісників в положеннях 3, 4, 15 та ін. [7]. За токсичністю НТ-2 токсин та Т-2 тетраол суттєво поступаються активності Т-2 токсину як в дослідах на лабораторних тваринах, так і в інших біологічних тест-системах (таблиця). Таким чином, нами показана принципова можливість мікробіологічної інактивації Т-2 токсину за допомогою дріжджової культури Deb. polymorphus 396. Аналіз даних літератури свідчить про можливість метаболічних перетворень Т-2 токсину в кишечнику щурів [10], а також бактеріальними угрупуваннями, виділеними з грунту та води [8, 11]. Застосований нами методичний підхід не вирізняється особливою оригінальністю, оскільки успішно був започаткований ще Ciegler et al [9] щодо детоксикації афлатоксинів за допомогою Flavobacterium aurantiacum. Однак, стосовно трихотеценових мікотоксинів наша спроба є першою, а з огляду на високу чутливість дріжджів до цієї групи метаболітів, — навіть унікальною. Природно виникає питання щодо можливого практичного використання цього феномену. Ми не виключаємо його реалізації в майбутньому з врахуванням частоти виявлення Т-2 токсину в зернових та актуальності цієї проблеми. Однак, успішне вирішення цього питання буде залежати від розробки відповідних технологій. Література |