|
МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 577.1.615 ОБ УЧАСТИИ ОКСИДА АЗОТА И СУПЕРОКСИДА В АПОПТОЗЕ ТИМОЦИТОВ, ВЫЗВАННОМ ПАПАВЕРИНОМ И НИТРОПРУССИДОМ НАТРИЯ Т.О. Кишко, С.Г. Шандренко, Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя Тимоциты по сравнению с другими типами клеток особенно уязвимы к повреждающему воздействию физических и химических факторов, вызывающему их гибель по пути апоптоза [1,2]. Механизм развития последнего связывают с чрезмерным образованием в организме свободных радикалов супероксида (О2-) и оксида азота (NO.)[3-8]. Предполагается [9,10], что эти радикалы быстро взаимодействуют между собой с образованием пероксинитрита (ONOO-)-, который, сильно окисляя высокомолекулярные соединения (липиды, белки, ДНК) тимоцитов, вызывает апоптоз. Вместе с тем есть данные, указывающие на то, что роль анионов супероксида в механизме апоптоза при действии некоторых химических индукторов незначительна [11,12]. Показано также, что NO может, наоборот, снижать частоту апоптоза тимоцитов, вызванную дексаметазоном [13], смягчать цитотоксическое действие О2-, ишемии, пероксидации липидов и других факторов на миокардиальные волокна и нервные клетки [14]. Это объясняют тем, что NO модифицирует тиоловые группы белков, играющих ключевую роль в апоптозе [15]. Существует мнение [14], что при определенном, оптимальном соотношении синтеза NO. и О2- в организме эти соединения не только не проявляют цитотоксического свойства, но даже необходимы для поддержания жизнеспособности клеток. Целью настоящей работы было изучить роль оксида азота и супероксидного аниона в развитии апоптоза тимоцитов, вызванного папаверином и нитропруссидом натрия (НП). Материалы и методы Тимоциты выделяли, как описано [25]. После декапитации животных у них извлекали тимус и помещали в раствор Хенкса с 10 мМ трис-HCl буфером (рН 7,3). Тимоциты получали протиранием тимуса через капроновое ситечко в среде Хенкса и 2 раза промывали их тем же раствором центрифугированием 5 мин при 1 тыс. об/мин. Полученные тимоциты (107 клеток/мл) розливали по 1 мл в 24-луночные пластиковые планшеты, добавляли 5 % инактивированную сыворотку телят и исследуемые эффекторы и инкубировали при 37 °С в СO2-инкубаторе. На протяжении 7 ч инкубации проводили подсчет живых и мертвых клеток в камере Горяева, окрашивая их трипановым синим. ЭПР-исследования проводили на радиоспектрометре “Varian E-109”. Для этого суспензию клеток замораживали в тефлоновой формочке в жидком азоте. Спектры ЭПР регистрировали при следующих условиях: напряженность магнитного поля 2500-3500 Gs, мощность СВЧ — 5 мВт (для регистрации сигнала свободных радикалов 0,2 мВт), температура жидкого азота. Для определения количества NO, образующегося, возможно, в тимоцитах, в состав последних включают ловушку NO, представляющую собой комплекс диэтилдитиокарбамата и двухвалентного железа (ДЭТК-Fe2+). Тимоциты инкубируют 20 мин при 37 °С в среде Хенкса, содержащей 0,1 мМ ДЭТК, затем клетки путем центрифугирования и ресуспендирования помещают в среду Хенкса, содержащую 0,1 мМ Fe2SO4, снова инкубируют 20 мин при 37 °С, промывают 2 раза и ресуспендируют в среде Хенкса. В результате такой обработки в мембранных компонентах тимоцитов формируется комплекс ДЭТК-Fe2+, способный улавливать и прочно удерживать NO в виде мононитрозильного комплекса железа с ДЭТК, который обладает парамагнитными свойствами и регистрируется методом ЭПР как указано выше. Результаты и обсуждение Присутствие папаверина и нитропруссида натрия в среде инкубации тимоцитов приводит к их гибели, которая отмечается в основном после 3-х часового латентного периода и, следовательно, характерна для апоптоза. При совместном использовании соединений наблюдается адитивность эффектов, что указывает в пользу различных взаимонесвязанных механизмов их цитотоксического действия [16]. Папаверин значительно ингибирует окислительное фосфорилирование, усиливает гликолиз и вызывает резкое ускорение катаболизма адениннуклеотидов, сопровождаемое снижением уровня АТР и накоплением продуктов этого катаболизма преимущественно в виде гипоксантина [17]. В процессе апоптоза, вызванного папаверином, в тимоцитах еще до их гибели значительно повышается суммарная активность ксантиноксидазы и отмечается переход ксантиндегидрогеназной формы этого фермента в ксантиноксидазную, функционирование которой служит одним из основных источников образования супероксида в тимоцитах, и при этом, усиливаются реакции перекисного окисления липидов [18]. С помощью метода ЭПР-спектроскопии нами показано, что через час инкубации тимоцитов с папаверином наблюдается существенное уменьшение величин сигналов ЭПР, характерных для убихинонных свободных радикалов и железо-серных центров, локализованных в цепях митохондрий, однако этот эффект при последующей их инкубации снижается (рис.4). Это может указывать на то, что папаверин ингибирует процессы транспорта электронов по цепям свободного биологического окисления или окисления, сопряженного с процессами фосфорилирования на начальном периоде аппоптоза тимоцитов. Следует отметить, что и в контрольных опытах в силу неблагоприятных условий длительной инкубации тимоцитов в солевой среде и без эффектора также происходит существенное уменьшение указанных сигналов ЭПР (рис.4). Во время инкубации тимоцитов без папаверина и в его присутствии отмечены изменения величин сигнала ЭПР, отражающего общее количество в клетке Mn2+ — содержащих ферментов. За первый час инкубации тимоцитов количество ферментов , содержащих восстановленный Mn2+, в контрольном эксперименте увеличилось больше, чем в опытном. При последующей инкубации тимоцитов (2 и 3 ч) в контроле происходило уменьшение этого показателя ниже исходного уровня, а в присутствии папаверина его величина значительно возрастала (рис.4). mn2+ входит в состав каталитических центров АТФ-аз и протеинкиназ, которые играют ключевую роль в катаболизме адениннуклеотидов, мембранотранспортных и регуляторных процессах клеток и, очевидно, участвуют в механизме цитотоксического действия папаверина. Наблюдаемое увеличение доли восстановленого mn2+ в ферментах, по нашему мнению, может быть следствием разобщения в тимоцитах електронтранспортных цепей и связанного с этим накопления электронов на отдельных участках, а также истощения фонда субстратов для этих ферментов. Возможно, на увеличение рассматриваемых сигналов ЭПР сказываются конформационные изменения в самих парамагнитных центрах или их лигандных окружениях. Апоптоз клеток, вызванный НП, обычно связывают с действием высобождающегося из него оксида азота. Не исключено, что определенный вклад в цитотоксическое действие НП вносят такие продукты его разложения как цианид и ионы ферроцианида [19-21]. Присутствие в среде инкубации НП приводит к появлению в спектрах ЭПР тимоцитов характерного синглетного несимметричного сигнала нитрозильного комплекса негемового железа с белками, содержащими парные SH-группы (gср=2,037, рис.3). В процессе инкубации клеток величина этого сигнала быстро растет. Так, за второй час инкубации прирощение его размаха в три раза больше, чем за первый час. Эти данные указывают на образование из НП оксида азота, который, возможно, и является основной причиной апоптоза. Сигналы СР и mn-содержащих белков определить в этих образцах не удалось, поскольку широкий и большой по величине сигнал нитрозильного комплекса перекрывает эти сигналы. В отличие от папаверина при инкубации тимоцитов с НП происходит существенное возрастание величины сигнала ЭПР, характерного для железо-серных центров. Следовательно, функция митохондрий при апоптозе тимоцитов, вызванном НП, не только не нарушена, но даже усиливается (рис.4). В силу того, что к гибели тимоцитов при действии папаверина и НП приводят неодинаковые механизмы, одни и те же химические вещества могут по разному влиять на жизнеспособность клеток. Это нашло подтверждение в проведенных нами исследованиях по изучению влияния модуляторов синтеза оксида азота, его акцепторов, и компонентов ксантиноксидазной системы на апоптоз тимоцитов, вызванный НП и папаверином. Так, присутствие в среде инкубации тимоцитов аргинина, являющегося субстратом NO-синтазы, значительно усиливает их гибель, вызываемую папаверином и, наоборот, увеличивает выживаемость клеток при действии НП. Аналоги аргинина N-метил-аргинин и L-канаванин, известные как ингибиторы NO-синтазы, влияли на апоптоз тимоцитов, вызванный папаверином и НП, подобно аргинину, но значительно слабее (рис.1). Однонаправленность влияний индуктора и ингибиторов синтеза no, выявляемых в пределах каждой из использованых моделей апоптоза, указывает на непричастность к даному механизму гибели клеток эндогенного синтеза no. Более того, нами не было обнаружено образование no в тимоцитах, которые инкубировали в течение 8 ч в среде Хэнкса, содержащем аргинин, с помощью реакции Грисса, и метода ЭПР-спектроскопии по образованию сигналов нитрозильных комплексов негемового железа с белками, содержащими парные sh-группы, а также мононитрозильного комплекса ДЭТК-fe2+ (g=2,03) в тимоцитах, предварительно обработанных растворами ДЭТК и сернокислого железа. По перечисленным показателям синтез no не был выявлен и в процессе апоптоза тимоцитов, вызванного папаверином. Полученные данные не согласуются с недавно проведенным исследованием, указывающем на образование no в митохондриях тимоцитов крыс в процессе апоптоза, вызванного метилпреднизолоном [8]. В отличие от наших исследований, в этой работе о синтезе no судили опосредовано: по образованию метгемоглобина, которое угнеталось n-метиларгинином. Но более вероятно, что окисление железа в гемоглобине при апоптозе связано с образованием супероксидных анионов, которое ингибируется n-метиларгинином. Возможно, что аргинин усиливает истощение макроэргов в тимоцитах, вызываемое папаверином, за счет активации энергозатратного цикла мочевины, субстратом которого он является. N-метиларгинин и L-канаванин как менее активно метаболизирующие соединения в этом отношении действуют на тимоциты слабее аргинина. При действии НП на тимоциты, когда энергообеспечивающие механизмы не повреждены, в неодинаковой мере проявляется регуляторное влияние аргинина и его аналогов, способствующее выживаемости клеток, например, участвуя в синтезе полиаминов, экранируя аргинин гистонов от метилирования, в аргинин-специфическом моно-АДФ-рибозилировании и т.д. Цитотоксическое действие НП существенно устранялось акцепторами NO. В частности, почти полностью предохраняли от апоптоза комплекс ДЭТК-Fe2+ и созданный нами препарат нитоксидел, представляющий собой растворимый комплекс Fe2+ c низкомолекулярным тиолсодержащим лигандом и аскорбиновой кислотой [22]. Они были способны образовывать прочные мононитрозильные комплексы с NO, успешно конкурируя при этом с NO-связывающими кеомпонентами клеток. Тиопролин, способный ковалентно связывать NO [23], также угнетал развитие апоптоза, но менее эффективно (рис.1). Как можно было ожидать, он не оказывал существенного влияния на выживаемость тимоцитов при действии на них папаверина. Неожиданностью оказалось то, что ДЭТК-fe2+ и нитоксидел сходным образом угнетали апоптоз тимоцитов, вызванный как НП, так и папаверином (рис.1). Такое универсальное цитопротекторное действие ДЭТК-fe2+ и нитоксидела как соединений, которые не проникают через клеточную мембрану, повидимому, состоит в том, что они во внеклеточной среде связывают и нейтрализуют no, благодаря наличию в этих комплексах двухвалентного железа, которое устраняет супероксид. О том, что роль последнего имеет значение при апоптозе тимоцитов, вызванном НП и особенно папаверином, указывают данные, представленные на рис.2. Из них следует, что роль ксантиноксидазной реакции как одного из основных источников клеточного образования супероксида в развитии апоптоза тимоцитов, вызванного папаверином, довольно значительна. Так, при наличии в среде субстрата ксантиноксидазы- гипоксантина гибель клеток под влиянием папаверина возрастает на 50-60 %, а в присутствии ингибитора этого фермента аллопуринола она наоборот снижается на 60 %. В апоптозе тимоцитов, вызванном НП, вклад супероксида, образующегося в результате ксантиноксидазной реакции, меньший: эфект гипоксантина незначителен, а аллопуринола в 2 раза слабее. Добавление к тимоцитам ксантиноксидазы (КсО) вместе с гипоксантином более, чем в 2 раза усиливает гибель тимоцитов, вызванную папаверином и существенно не сказывается на гибели тимоцитов, вызванной НП. Возможно, что в последнем случае супероксид, образующийся внеклеточно из гипоксантина, не проявляет цитотоксического действия, поскольку оно нейтрализуется высвобождающимся из НП оксидом азот Эти данные подтверждают предположение о том, что в определенных, оптимальных соотношениях концентраций no. и О2- их цитотоксические свойства не проявляются [14]. Только в эквимолярных количествах no. и О2- могут взаимодействовать между собой с образованием пероксинитрита, способного легко окислять органические соединения. Излишек продукции no. фактически устраняет О2--зависимое окисление, чему способствует также редокс-активное железо молекулы НП [24]. Таким образом, полученные данные указывают на то, что в патогенезе апоптоза тимоцитов, вызванного НП и папаверином, ведущую роль играют соответственно NO. и О2-. Они участвуют в реализации совместного цитототоксического действия НП и папаверина независимо друг от друга ( на это указывает суммация эфектов НП и папаверина на тимоциты), очевидно, потому, что NO. высвобождаемый из НП и О2- образованный в результате активации ксантиноксидазной реакции, а также мишени воздействия внутри клетки компартментализованы. Тимоциты не могут синтезировать NO.. Его образование также не обнаруживается в тимоцитах при индукции и развитии апоптоза. Литература |