УДК 615.9:615.099

ІНДУКЦІЯ ПЕРЕДПУХЛИННИХ СТАНІВ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ КРОТОНОВИМ АЛЬДЕГІДОМ

Є.А. Баглій, д.м.н., П.Г. Жмінько, к.б.н., Н.М. Недопитанська, к.б.н., О.В. Решавська, В.С. Лісовська

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя, м. Київ

Кротоновий альдегід (2-бутеналь, бета-метилакролеїн) відноситься до вльфа-бета-ненасичених альдегідів і є досить розповсюдженою сполукою у довкіллі [1, 2]. В останні роки в Україні набуло актуальність питання про використання кротонового альдегіду (КА) в якості одоранту природного газу. Це, в свою чергу, потребує всебічного аналізу вже існуючих даних щодо токсикологічних властивостей КА, зокрема наслідків віддаленої дії на організм людини.

Питання про можливу канцерогенну небезпеку для людини КА та інших альфа-бета-ненасичених альдегідів, зокрема акролеїну, постало у зв`язку з відомостями виявлення адуктів ДНК, таких як 1-N2-пропанодезоксигуанозину [3]. Вони утворюються під час безпосередньої взаємодії з ДНК як у прокаріотів, так і в культурах клітин китайського ховрашка, фібробластів пігментної ксеродерми людини, тощо [3-7]. Відомо також, що такі адукти утворюються під час метаболічної активації відомих канцерогенів — нітрозопіролідину та циклофосфаміду [3, 7, 8]. Імовірно, що саме вони є кінцевими канцерогенами, які обумовлюють онкогенний ефект [7].

В літературі представлені дані хронічного експерименту на щурах [9]. При введені КА з питною водою в дозі 8,4 мг/кг маси тіла протягом 113 тиж спостерігалося вірогідне збільшення кількості доброякісних пухлин, зокрема пухлин печінки, а також частоти гіперпластичних вузликів (ГВ) печінки. Автори вважають, що розвиток ГВ пов'язаний з утворенням адуктів 1-N2-пропанодезоксигуанозину ДНК.

Метою наших досліджень було вивчення індукції передпухлинних станів в печінці КА.

Матеріали та методи дослідження

Враховуючи органотропні, генотоксичні властивості КА які реалізуються утворенням передпухлинних ГВ в печінці, в своїх дослідженнях онкогенного потенціалу КА ми використали метод індукції перенеопластичних пошкоджень печінки [16]. Роль ініціатора виконував КА (95 %-ний, трансізоформа), додатково для підсилення ефекту застосовували часткову гепатектомію. В подальшому, для прискорення реалізації онкогенного ефекту КА, вводили фенобарбітал (ФБ), який відомий своєю промоторною дією. Маркером трансформованих гепатоцитів в даній моделі є зміна активності цілої низки внутрішньоклітинних ферментів, в тому числі раковоембріонального ферменту гама-глутамілтранспептидази (гама-ГТП) [11, 12].

Експерименти проводили на нелінійних білих щурах-самцях масою 160-180 г. Тварини були поділені на чотири групи по 15 у кожній. КА вводили в організм тварин двома способами: інгаляційно або внутрішньошлунково. Щури 1-ої групи отримували КА в газопарових камерах в концентрації 5,23 мг/м³ (експозиція 4 год, 105 діб). Сумарна доза становила 9,5 мг — дещо вища ніж ГДК. Тварини 2-ої групи також інгаляційно отримували препарат в кон-центрації 0,017 мг/м³ (експозиція 2 год, 108 діб). Сумарна доза становила 0,17 мг — на рівні природного фону. Враховуючи, що генетичні пошкодження, індуковані КА в гепатоцитах, можуть накопичуватися в геномі, були розраховані сумарні дози альдегіду, які потрапляють в організм людини в межах існуючих гігієнічних нормативів (ГДК повітря робочої зони — 0,5 мг/м³) [1]. При екстраполяції цих доз на щурів сумарна доза 9,5 мг може потрапити з повітрям робочої зони, доза 0,17 мг — з атмосферним повітрям. В 3-ій групі КА вводили перорально в дозі 8,4 мг/кг маси тіла, тобто на рівні ефективної дози в хронічному експерименті [9]. Препарат вводили зондом у шлунок 5 раз на тиждень (всього 105 введень). Тварини 4-ої групи КА не отримували.

Після 21 тижневого терміну введення КА щури всіх груп були прооперовані з вилученням 2/3 печінки, а далі 6 тиж в питну воду тваринам добавляли 0,5 %-ний розчин фенобарбіталу (ФБ). Схема експерименту наведена на рис. 1.

Щурів присипали в випаровуваннях ефіру, робили розтин, під час якого вилучали шматочок печінки і після фіксації кріостатних зрізів у охолодженому ацетоні проводили гістохімічну реакцію на активність гама-ГТП.

Після сканування гістохімічних препаратів за допомогою пакету комп'ютерних програм "Adobe Photoshop" проводили вимірювання середньої площі ГВ в мм² на особину в межах 1 см². Дані оброблені загальноприйнятими методами варіаційної статистики.

Результати та їх обговорення

Впродовж експерименту не виявлено ніяких відхилень в стані тварин та їх маси, не зафіксовано загибелі, пов`язаної з дією речовин.

Результати морфометричних вимірювань ГВ наведені в таблиці. Аналіз отриманих даних свідчить, що за кількістю тварин, у яких виявлені пренеопластичні пошкодження печінки та за частотою ГВ між групами достовірної різниці немає. Підвищення вдвічі (р<0,01) середньої площі ГВ печінки порівняно з контролем встановлене тільки у щурів 1-ої групи, тобто в групі. Слід зазначити, що середня площа ГВ печінки щурів у групах з інгаляційним введенням КА збільшується порівняно з групою щурів, що отримували КА внутрішньошлунково, незважаючи на те, що для останніх доза у 15 разів вище інгаляційної. На рис. 2 представлений графік розмірів ГВ, виявлених в печінці щурів різних груп, який крім визначення середньої функції, демонструє істинний розподіл розмірів ініційованих ГВ. Незважаючи на широкий розподіл коливань розмірів вузликів, відстежується тенденція до збільшення їх у 1-ій групі, що підтверджується і статистично.

Отримані результати вказують на те, що КА в умовах проведеного експерименту не проявляє ініціюючих властивостей, характерних для класичних канцерогенів. Але необхідно зазначити, що з підвищенням дози впливу КА спостерігається збільшення гетерогенності розмірів площин ГВ. Це дозволяє припустити, що під впливом КА в печінці утворюються клони гепатоцитів, більш чутливих до мітогенних стимулів — гепатектомії та фенобарбіталу. Найбільш виразно це проявилося у щурів 1-ої групи — максимальне значення середньої площини ГВ становило більше 1 мм²/см².

Якщо утворення адуктів ДНК в гепатоцитах щурів призводить до розвитку ГВ, то з підвищенням концентрації КА в організмі повина збільшуватися кількість трансформованих гепатоцитів. Пов`язати появу таких вузликів з накопиченням адуктів ДНК в гепатоцитах, на наш погляд, неможливо через практичну відсутність відповідної залежності від дози впливу. Не виключено, що збільшення кількості адуктів ДНК в гепатоцитах призводить до порушень геному, несумісних з їх подальшою життєдіяльністю і, як результат — до загибелі. У цьому разі, при тривалому введенні КА за схемою експерименту, був би зворотній ефект у тварин, які отримують високу дозу, осередків трансформованих гепатоцитів було б менше, ніж у щурів, які отримували малу дозу. Між тим, відсутність токсичних ефектів та статистично вірогідне збільшення площини ГВ у тварин, які отримували інгаляційно високу дозу КА порівняно з щурами, які отримували малу дозу, а також порівняно з щурами, які отримували внутрішньошлунково значно більшу дозу, виключає можливість загибелі трансформованих гепатоцитів в умовах проведеного експерименту.

На користь такого припущення свідчить аналіз досліджень по утворенню адуктів ДНК під впливом КА. У системах in vitro адукти утворюються не завжди і лише під впливом великих доз (від 70 до 700 мг) [1]. Мутагенна активність КА у різних тест системах in vitro та in vivo також виявлена лише в діапазоні великих доз. Токсичність КА не дає змоги досягнути таких рівнів впливу на тканини організму in vivo. Проте, при пероральному введені КА щурам лінії Фішер F-344 були зареєстровані адукти у печінці, адукти були знайдені і у контрольних тварин [1]. Встановлена навіть загальна кількість 1-N2-пропанодезоксигуанозину in vivo без експозиції до КА у ДНК гуанінових основ печінки: мишей — 1,0-1,7/106, щурів — 0,2-1,0/106 , людини — 0,3-2,0/106 [13]. При цьому канцерогенність акролеїну, який призводить до утворення адуктів, в адекватних хронічних експериментах на двох видах тварин не встановлена [14].

Суперечливість представлених даних і невизначенність ролі вищезгаданих адуктів у механізмі канцерогенезу не дає змогу однозначно відносити КА до генотоксичних канцерогенів [1]. Більш імовірно, що пошкодження ДНК, викликані дією КА на організм щурів, не призводить до трансформації гепатоцитів, а лише стимулюють проліферацію та селекцію трансформованих ендогенними факторами гепатоцитів.

Таким чином, при хронічній інгаляції КА у концентрації 5,23 мг/м³ протягом 21 тиж у щурів виникають передпухлинні пошкодження печінки у вигляді гама-ГТП — позитивних ГВ. Встановлено, що індукція ГВ більш виразна при інгаляційному шляху введення КА порівняно з пероральним. Зареєстровано промоторний ефект КА за критерієм збільшення площини ГВ на см² в печінці щурів.

Література
1. Crotonaldegyde. IARС Monographs of the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. Dry cleaning, some chlorinated solvents chlorinated solvents and other industrial chemicals. —Lyon. —1995. —V. 63. —P. 373-391.
2. Enviromental Chemicals Data and Information Network. —Ispra, JRC-CEC, last update: 02.09.93.
3. Chung F.-L., Yang R., Hecht S.S. Formation of cyclic 1,N2- propanodeoxyguanosine adducts in DNA upon reaction with acrolein or crotonaldehyde. // Cancer Res. —1984. —44. —Р. 990-995.
4. Foiles P.G., Akerkar S.A., Miglietta L.M., Chung F.-L. Formation of cyclic deoxyguanosine adducts in Chinese hamster ovary cells by acrolein and crotonaldehyde. // Carcinogenesis. —1990. —11. —P. 2059-2061.
5. Curren R.D., Yang L.L., Conklin P.M., Grafstrom R.C., Harris C.C. Mutagenesis of xeroderma pigmentosum fibroblasts by acrolein // Mutat. Res. —1988. —209. —Р. 17-22.
6. Chung F.-L., Yang R., Hecht S.S. Detection of 1,N2-propanodeoxyguanosine adducts in DNA of rats treated with N-nitrosopyrrolidine and mice treated with crotonaldehyde. // Carsinogenesis. —1989. —10. —Р. 1291-1297.
7. Eder E., Scheckenbach S., Deininger,C., Hoffman C. The posible role of a,b-unsaturated carbonyl compounds in mutagenesis and carcinogenesis // Toxicol. Lett. —1993. —67. —Р. 87-103.
8. Eder E., Hoffman C. Identification and characterization of deoxyguanosine-crotonaldehyde adducts. Formation of 7,8 cyclic adducts and 1,N2,7,8 bys-ciclic adducts. // Chem. Res. Toxicol. —1992. —5. —Р. 802-808.
9. Chung F.-L., Tanaka T., Hecht S.S. Induction of liver tumors in F344 rats by crotonaldehyde // Cancer Res. —1986. —46. —Р. 1285-1289.
10. Ito N., Shirai T., Hasegawa R. Medium-term bioassays for carcinogens. // Mechanism of carcinogenesis in risk identification / Ed. H. Vainio, P.N. Magee, D.B. Mc Gregor, A.J. Mc Michael.-Lyon, International Agency for Research on Cancer, —1992. —P. 353-388.
11. Винарчук М.П., Быкорез А.И. Ранние гистохимические маркеры гепатоканцерогенеза. // Эксперим. онкология. —1984. —6. —N 1. —С. 11-16.
12. Gleiberman A.S., Abelev G.I. Cell hjsition and cell interactions in expression of fetal phenotype of hepatocyte // Intern. Rev. Cytol. —1985. —V. 95. —P. 229-266.
13. Nath R.G., Chung F.-L. Detection of exocyclic 1,N2-propanodeoxyguanosine adducts as common DNA lesions in rodents and humans. Proc. natl. Acad. Sci. USA. —1994. —V. 91 —P. 7491-7495.
14. Acrolein. IARС Monographs of the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. V. 63. Dry cleaning, some chlorinated solvents chlo-rinated solvents and other indastrial chemicals. —Lyon. —1995. —P. 337-372.