|
ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ УДК 577.152.173 КСАНТИНОКСИДАЗА КАК КОМПОНЕНТ СИСТЕМЫ ГЕНЕРИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В.В. Сумбаев, к.б.н., Одесский государственный университет им. И.И. Мечникова Ксантиноксидаза была открыта независимо друг от друга украинским ученым Горбачевским и немецким Шардингером. Этот фермент (КФ: 1.2.3.2) катализирует превращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту, а также окисление ряда птеридинов, альдегидов и имидазолов [1]. При дефиците кислорода ксантиноксидаза функционирует как НАД+-зависимая ксантиндегидрогеназа (КФ: 1.2.1.37), причем механизмы действия этих двух функциональных форм принципиально различаются [2, 3]. В конце 1980-х годов изучение ксантиноксидазы становилось все более актуальным в связи с открытием мощной супероксидобразующей, канцерогенной и апоптогенной активностей фермента [4]. Началась "вторая волна" исследований роли ксантиноксидазы в биохимических процессах, когда выяснилось, что ксантиноксидаза является главной системой генерирования активных форм кислорода в живых организмах. Основная функция ксантиноксидазы состоит в образовании мочевой кислоты из первичных продуктов окисления аденина и гуанина. Ксантиноксидаза (ксантиндегидрогеназа) занимает, фактически, центральное место в распаде пуринов. Эти две функциональные формы являются основным фактором, лимитирующим образование мочевой кислоты в животном организме [5]. Как уже было сказано, мочевая кислота у некоторых животных, в том числе и у человека, является конечным продуктом распада пуринов, в связи с чем интенсивность утилизации продуктов дезаминирования пуринов у них прямо зависит от активности ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы [1]. У других же организмов, способных расщеплять мочевую кислоту, интенсивность распада мочевой кислоты и последующих компонентов целиком зависит от активности ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы, так как активность уриказы прямо зависит от количества образующейся мочевой кислоты [5, 6]. Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа обеспечивают утилизацию всего "лишнего" ксантина, который при недостаточной утилизации способен вызывать миалгии и инфаркты почек [7]. У животных, растений и аэробных микроорганизмов мочевая кислота образуется в ходе ксантиноксидазной реакции, и только незначительная её часть образуется по ксантиндегидрогеназному пути [2, 3]. Структура и механизмы действия ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы Структурная организация ксантиноксидазы (ксантиндегидрогеназы) достаточно сложна. Фермент имеет димерную структуру, причем при разделении его на мономеры обнаруживается, что каждый из них в отдельности обладает каталитической активностью [8]. Молекулярная масса фермента, определенная при помощи диск-электрофореза в ПААГ, составляет 283 кД [8]. Каждый мономер состоит из трех неидентичных субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями. Молекулярная масса субъединиц, определённая тем же методом, сотавляет соответственно 135, 120 и 40 кД [8]. В состав фермента входит ФАД, ковалентно связанный с его белковой частью. На каждый мономер приходится одна молекула ФАД. Белковая часть фермента богата цистеином и содержит 60–62 свободные SH-группы. В структуре ксантиноксидазы имеются также железосерные центры с типом кластера 2 Fe — 2 S. В состав фермента входит молибден, который в невозбуждённом состоянии пятивалентен и находится в виде так называемого молибденового кофактора — он связан двумя s-связями с ФАД, двумя — с шестизамещённым птерином, протонированным в положении 7 и одной — с серой цистеина. Показано, что в состав ксантиноксидазы в расчёте на каждый мономер входит также одна надсульфидная группа ( — S — SH), которая, возможно, и служит для связывания молибдена [1, 8-12]. В ходе исследований было установлено, что птерин и надсульфидная группа не принимают непосредственного участия в каталитическом акте [1, 13]. В гомогенном состоянии фермент быстро инактивируется из-за конформационных изменений, возникающих благодаря наличию большого числа свободных SH-групп [8]. Показано, что фермент способен постепенно утрачивать молибден [12]. Выяснилось, что активность ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы прямо зависит от содержания молибдена в организме [12, 14]. Механизм действия ксантиноксидазы достаточно сложен. Первоначально происходит окисление железа в составе железосерного центра фермента с образованием супероксидного радикала [15-17]. ФАД дегидрирует субстрат, превращаясь в сверх активный семихинон, способный дегидрировать даже воду с образованием ФАДН2, немедленно восстанавливающего супероксид в Н2О2 [18]. Оставшийся у ФАД электрон может восстановить окислившийся железосерный центр. Два гидроксила, образовавшиеся в результате дегидрирования воды на двух мономерах ксантиноксидазы, конденсируются в молекулу Н2О2 [18]. Отдавая электрон, молибден расщепляет перекись водорода на ОН· и ОН-, изменяя при этом свою валентность. Возбужденный молибден связывается с гидроксил-анионом, отнимает у него утраченный электрон и гидроксилирует субстрат, передавая последнему гидроксильный радикал [15-17]. Схематически механизм действия ксантиноксидазы представлен на рис. 1. Механизм действия ксантиндегидрогеназы относительно прост по сравнению с механизмом действия ксантиноксидазы. Первоначально фермент атакует p-связь в структуре субстрата. Происходит это следующим образом: молибден отдает электрон, разрывает p-связь между n и c в положениях 2 и 3 или 7 и 8 в структуре пуринового ядра субстрата с присоединением электрона к азоту. Активированный субстрат легко присоединяет воду, вода диссоциирует на Н+ и ОН-, после чего протон присоединяется к азоту, а молибден связывается с гидроксил-анионом, отнимает у него утраченный электрон и гидроксилирует субстрат, передавая последнему гидроксильный радикал. Таким образом, субстрат гидратируется. Образовавшийся гидрат субстрата легко дегидрируется при участии ФАД, который тут же окисляется, передавая электроны и протоны на НАД+, являющийся конечным акцептором электронов и протонов в данной реакции [2-3, 19]. В случае с ксантиндегидрогеназой железосерные центры не функционируют и супероксид не образуется. В связи с этим реакция идёт по более медленному дегидрогеназному пути через стадию гидратации субстрата. В случае же с ксантиноксидазой образуется супероксид, в связи с чем реакция должна идти быстрее, ввиду необходимости его обезвреживания. Именно поэтому гидратации субстрата не происходит и субстрат немедленно подвергается дегидрированию [2, 3]. Регуляция активности ксантиноксидазы Как мы уже упоминали, путь, по которому осуществляется преваращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту, зависит в первую очередь от условий, в которых функционирует фермент, отвечающий за данный процесс. При дефиците кислорода, снижении рН, а также избытке никотинамидных коферментов ксантиноксидаза функционирует как НАД-зависимая ксантиндегидрогеназа [2, 3]. Индукторами активности ксантиноксидазы являются интерферон и молибдаты [4, 12]. Интерферон индуцирует экспрессию генов, кодирующих субъединицы ксантиноксидазы, а молибден (в составе молибдатов) активирует высвобождение ксантиноксидазного апофермента из пузырьков аппарата Гольджи, что приводит к увеличению количества активных молекул ксантиноксидазы. Следует заметить, что активность ксантиноксидазы в значительной степени зависит от поступления в организм экзогенного молибдена. Суточная потребность человека в молибдене составляет 1-2 мг [14]. Показано, что в раковых клетках активность ксантиноксидазы повышается в 5-20 раз [14]. Кроме того, восстановители, такие как аскорбиновая кислота, глутатион и дитиотреитол, в концентрациях 0,15-0,4 мМ активируют ксантиноксидазу, поддерживая ФАД и железосерные центры в структуре фермента в восстановленном состоянии, что увеличивает количество образуемого ферментом супероксида и, соответственно, количество окисленных молекул субстрата. При концентрациях 0,6 мМ и выше все восстановители неконкурентно ингибируют ксантиноксидазу. Ингибирующий эффект может быть обусловлен конкуренцией между восстановителями и ферментом за присоединение молекулярного кислорода, а также гиперредукцией ФАД, что затрудняет нормальное дегидрирование субстрата [15]. Все описанные восстановители при концентрациях 0,1 мМ и выше неконкурентно ингибируют ксантиндегидрогеназу, что обусловлено редукцией ФАД, вызывающей торможение дегидрирования гидратов субстрата, которые, в свою очередь, как неустойчивые соединения распадаются на субстрат и воду [18]. Ингибиторами ксантиноксидазной активности являются вольфраматы. Вольфрам замещает молибден в активном центре фермента, что приводит к его необратимой инактивации [12]. Кроме того, изомер гипоксантина — аллопуринол, а также многие производные птеридина (в том числе фолиевая кислота) и имидазола (гистидин) изостерически ингибируют ксантиноксидазу [16]. Конкурентным ингибитором ксантиноксидазы является также кофеин (1,3,7-триметилксантин). Однако, попадая в животный организм, кофеин деметилируется до 1-метилксантина и не может быть ингибитором ксантиноксидазы. Более того, данный метаболит превращается при участии ксантиноксидазы в 1-метилмочевую кислоту [20]. Мощными изостерическими ингибиторами ксантиноксидазы, обезвреживающими, кроме того, образуемый ею супероксид, являются производные диарилтриазола [21]. В структуре ксантиноксидазы имеется аллостерический центр, представленный, как было рассчитано, одним остатком гистидина, одним остатком серина, двумя остатками тирозина и одним остатком фенилаланина. Аллостерическими ингибиторами ксантиноксидазы являются кортикостероиды, полихлорбифенилы и полихлордибензодиоксины, связывающиеся с аллостерическим центром фермента. Интересно отметить, что аллостерические ингибиторы ксантиноксидазы снижают продукцию ферментом супероксида [22, 23]. На рис. 3 показано расположение 4,9-дихлордибензодиоксина в аллостерическом центре ксантиноксидазы. Субстратная специфичность ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа не являются строго специфичными к гипоксантину и ксантину и могут катализировать окисление около тридцати алифатических и ароматических альдегидов [1]. Кроме этого, обе функциональные формы фермента могут окислять различные птерины (2,6-диоксиптеридин и др.) до оксиптеринов, а также аденин до 2,8-диоксиаденина [24]. Установлено, что обе функциональные формы фермента окисляют гистидин в 2-оксигистидин [16]. Механизм окисления такой же, как и в случае с гипоксантином и ксантином. Известно также, что кислородзависимая форма фермента (то есть непосредственно ксантиноксидаза) окисляет цистеин в цистеинсульфинат [16]. Дегидрированный цистеин захватывает гидроксил, связанный с молибденом, превращаясь в цистеинсульфенат, окисляющийся в присутствии Н2О2 в цистеинсульфинат [16]. Ксантиноксидаза способна проявлять НАД-диафоразную активность, а также окислять оксид азота (NO) в NO2- [4]. Локализация ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы в тканях животного организма Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа присутствуют практически во всех тканях животного организма. Наивысшей удельной активностью эти две функциональные формы обладают в печени, в цитозоле гепатоцитов, Купферовских клеток и эндотелиальных клеток [25]. Практически вся мочевая кислота в организме образуется именно в печени [25]. После печени по количеству ксантиноксидазы (ксантиндегидрогеназы) следуют слизистая оболочка тонкого кишечника, где удельная активность фермента на порядок ниже, чем в печени, а затем почки и головной мозг, однако в данных органах удельная активность ксантиноксидазы довольно низка [14]. В больших количествах фермент присутствует также в молоке, которое очень часто служит объектом для его выделения [26]. Роль ксантиноксидазы, как генератора активных форм кислорода, в биохимических процессах В 1991 г. было установлено, что повышение активности ксантиноксидазы вызывает достоверное увеличение активности супероксиддисмутазы и каталазы [27-29]. В последние годы было установлено, что при повышении активности ксантиноксидазы увеличивается активность глутатионпероксидазы. Так как в результате ксантиноксидазной реакции происходит образование большого количества перекиси водорода, то такой процесс вполне возможен [27]. В то же время, ксантиноксидаза является мощным образователем супероксидного радикала (на каждый мономер фермента приходится только 1 молекула ФАД и два железосерных центра, в связи с чем супероксид может образовываться в избытке [30, 31]), способного индуцировать процессы свободнорадикального окисления с образованием органических гидроперекисей. Se-зависимая глутатионпероксидаза разрушает гидроперекиси. В связи с этим активность глутатионпероксидазы также может повышаться [28]. Нами установлено, что индукция ксантиноксидазы натрия молибдатом вызывает активацию глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, а также снижает восстановительный потенциал глутатиона в печени крыс. Уровень диеновых конъюгатов при этом значительно повышается, а содержание малонового диальдегида практически не изменяется. Подавление ксантиноксидазной активности у крыс введением специфического ингибитора — вольфрамата натрия вызывает обратный эффект — снижение активностей глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, увеличение восстановительного потенциала глутатиона в печени животных. Показатели перекисного окисления липидов (количество диеновых конъюгатов и малонового диальдегида) при этом значительно снижаются [31]. Как мы уже отмечали, на каждый мономер ксантиноксидазы приходится одна молекула ФАД, обезвреживающая супероксид, и два железосерных центра, генерирующих его, в связи с чем данный радикал может образовываться в избытке. Кроме того, супероксид является предшественником других активных форм кислорода — гидроксильного радикала и перекиси водорода. Установлено, что повышение количества активных форм кислорода не только индуцирует процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов, но и вызывает повреждения ДНК, что сопровождается возникновением точковых мутаций [4]. Получены убедительные доказательства в пользу того, что повреждение ДНК активными формами кислорода, генерируемыми ксантиноксидазой, приводит к трансформации нормальной клетки в раковую [4]. Установлено также, что индукция активности ксантиноксидазы протекает практически во всех случаях одновременно с индукцией активности синтазы оксида азота за счет активации экспрессии генов ее индуцибельной изоформы [32]. Синтаза оксида азота (NO-синтаза, NOS — nitric oxide synthase, КФ 1.14.13.19) катализирует образование NO и цитруллина из аргинина и О2 через N-оксиаргинин [32]. В качестве донора электронов фермент использует NADH+H+ [32]. NOS в организме животных представлена тремя изоформами — индуцибельной (iNOS) и двумя конститутивными — эндотелиальной (eNOS) и нейрональной (nNOS). Все три изоформы состоят из гомодимеров, включающих редуктазный, оксигеназный и кальмодулинсвязывающий домены, обладают сходным механизмом действия, а различаются молекулярной массой [32]. Для проявления каталитической активности NOS требуются кофакторы — кальмодулин, Са2+, (6R) — 5, 6, 7, 8-тетрагидро-L-биоптерин, FAD и FMN. Функцию каталитического центра выполняет тиолсвязанный гем [1]. Установлено, что ксантиноксидаза и индуцибельная синтаза оксида азота имеют, в основном, общие индукторы, такие как, например, интерферон в одинаковой степени индуцирующий активность ксантиноксидазы и NO-синтазы [4, 33]. Показано, что супероксид легко взаимодействует с NO с образованием ядовитого пероксинитрита (ONOO-). Пероксинитрит еще более активно, чем супероксид повреждает ДНК, а кроме того, мембраны клеток стенок сосудов, облегчая таким образом проникновение раковых клеток через них [4]. Супероксид, NO и пероксинитрит являются лигандами гема и поэтому легко ингибируют активность всех изоформ цитохрома Р450 [34, 35]. Кроме того, данные соединения подавляют экспрессию генов, кодирующих любые изоформы цитохрома Р450 [34, 35]. Генерируемый ксантиноксидазой супероксид, а также NO, но не пероксинитрит, при высоких концентрациях являются индукторами апоптоза (генетически запрограммированной гибели) клеток [33, 36]. Именно из-за образования пероксинитрита при взаимодействии супероксида и NO одновременная индукция ксантиноксидазы и синтазы оксида азота в раковых клетках препятствует их гибели по механизму апоптоза [33]. Супероксид или NO (но не пероксинитрит) взаимодействуют с тиоредоксином, высвобождая связанную с ним треонин/тирозиновую протеинкиназу ASK-1 (Apoptotic signal regulating kinase 1), ответственную за активацию экспрессии гена, кодирующего белок р53 — главный апоптогенный белок [37-40]. Этот белок предотвращает возможность митотического деления клетки, подавляя активность митогенного фактора МРF. МРF состоит из циклина А, который связывается с тирозиновой протеинкиназой р33cdk2. Комплекс циклин А-р33cdk2 связывается, в свою очередь, с транскрипционным фактором E2F и фосфорилирует белок p107Rb. Связывание этих четырех белков в промоторных участках активирует гены, необходимые для репликации ДНК. Белок, во-первых, ингибирует фосфорилирование белка р107Rb — члена митогенного фактора МРF, а, во-вторых, вызывает синтез белка р21 — ингибитора циклинзависимых тирозинкиназ [40]. Белок, р53 устраняет кальциевый барьер и ионы Са2+ в большом количестве проникают внутрь клетки, где активируют Са2+-зависимую эндонуклеазу, расщепляющую ДНК [40], а также кальций-зависимые протеиназы — кальпаины I и II [41]. Кальпаины I и II активируют протеинкиназу С, отщепляя от нее пептидный фрагмент, подавляющий активность данного фермента, а также расщепляют белки цитоскелета. На этой стадии р53 активирует, кроме того, биосинтез цистеиновых протеиназ — каспаз. Каспазы (caspase — цистеиновые протеиназы, расщепляющие белки по остаткам аспарагиновой кислоты) расщепляют поли-(АДФ-рибозо)-полимеразу (ПАРП), которая синтезирует поли-АДФ-рибозу из НАД+. Поли-АДФ-рибозилирование гистоновых белков хроматина класса 1Н при фрагментации ДНК стимулирует репарацию и препятствует дальнейшей фрагментации ДНК [42]. Основным субстратом каспаз являются интерлейкины 1b-IL. Кроме того, установлено, что каспаза-3 путем ограниченного протеолиза активирует специфическую ДНКазу, которая фрагментирует ДНК на высокомолекулярные фрагменты. В процессе апоптоза на этой же стадии наблюдается активация сериновых протеиназ — гранзима А и гранзима В, расщепляющих гистоновые и негистоновые белки хроматина, а также белки ядерного матрикса и других ядерных протеиназ неизвестной природы, расщепляющих гистоновые белки и ДНК — топоизомеразы. Предполагают, что активация данных протеиназ опосредуется р53 [41]. Таким образом, ДНК фрагментируется, а жизненно важные белки клетки разрушаются и клетка погибает. Процесс апоптоза завершается за 3-12 часов [40]. Кроме того, установлено, что генерируемый ксантиноксидазой супероксид вызывает деполяризацию митохондрий, высвобождая из них цитохром с, связывающийся c белком Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor) и каспазой 9. Данный комплекс активирует каспазу 3, в свою очередь активирующую каспазы 6, 7, о роли которых в апоптозе было рассказано выше. Показано, что культивирование клеток в условиях оксидативного стресса, вызванного ксантиноксидазой (создается внесением в культуру высокоочищенного препарата ксантиноксидазы и ксантина), происходит накопление апоптогенного белка р53 и клетки погибают по механизму апоптоза [36]. Активация образования NO в данных условиях ингибирует экспрессию генов, и, соответственно, синтез белка р53, в результате чего клетки не погибают [36]. Доказано, что данный эффект вызывается образованием пероксинитрита при взаимодействии супероксида и NO [33]. То есть, пероксинитрит обладает в данном случае цитопротекторным действием. В настоящее время механизмы индукции канцерогенеза, а также апоптоза при участии генерируемых ксантиноксидазой активных форм кислорода, остаются мало изученными. Тем не менее, не вызывает сомнений, что ксантиноксидаза, один из наиболее важных ферментов живых организмов, является главной системой генерирования активных форм кислорода. Литература |