|
ТОКСИКОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВ УДК 591.465.1:612.014.4: 615.27 ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ И NO-СИНТАЗЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ АУТОИММУННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЯИЧНИКОВ У МЫШЕЙ Т.Ю. Вознесенская, А.Н. Корнийчук, Т.В. Блашкив, И.Н. Алексеева, И.Р. Янчий, А.Г. Портниченко, Ю.П. Бидзиля, Р.И. Янчий Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, г. Киев В первой половине 90-х годов ВОЗ зафиксировала в ряде стран Восточной Европы наличие особого кризиса, получившего название "кризиса здоровья и смертности", который выражается в увеличении уровня заболеваемости, снижении рождаемости, а также повышенной смертности людей трудоспособного возраста. Важнейшей причиной этого кризиса, наряду с обнищанием значительной части (до 1/4) населения этих стран и распадом служб здравохранения, признан социальный стресс, обусловленный безработицей, вынужденными миграциями, утратой уважения к себе и веры в будущеее, страхом перед возросшей преступностью, конфликтами на работе, в семье и т.п. Есть основания считать, что в условиях этого кризиса могут возникать замкнутые порочные циклы типа "нарушения адаптации организма — биохимические и физиологические отклонения — нарушения генетического гомеостаза (мутации) — вторичные (приобретенные) иммунодифициты — возрастание подверженности различным (инфекционным и неинфекционным) заболеваниям — дальнейшие нарушения адаптации и т.д. [3]. Описанная ситуация имеет существенное значение для проблематики лекарственного мутагенеза. С одной стороны, не исключено, что в условиях кризиса здоровья люди, применяющие лекарственные средства, приобретают повышенную чувствительность к различным неблагоприятным побочным эффектам лекарств. К тому же некоторая часть населения может употреблять лекарства и другую "парафармацевтическую" продукцию бесконтрольно и неумеренно, что является, в частности, одной из признанных причин иммунодефицитов. При этом крайне важно, что широко распостраненная в человеческой популяции иммунологическая неполноценность людей и сложная экологичекая обстановка, отмечаемая в настоящее время, в условиях которой человек нередко подвергается одновременному воздействию нескольких токсических факторов различной природы, включая эндогенные мутагенные метаболиты, создают потенциально провокационный фон для проявления токсических свойств лекарственных преператов. Целью этого исследования стало изучение эффекта 1) блокатора кальциевых каналов верапамила на количество овариальных ооцитов и на процесс их мейотического созревания in vitro, в зависимости от дозы, способа введення и режима введення препарата; 2) неспецифических фармакологических блокаторов предшественника NO, NOS: NG-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) и NG-монометил-L-аргинина (L-NMMA), которые угнетают все изоформы NOS, на количество овариальных ооцитов и на состояние их мейотического созревания у мышей с аутоимунным повреждением яичников. Материалы и методы исследования В опытах использовали самок белых нелинейных и линии СВА мышей (на стадии диэструса) в возрасте восьми недель, масой 20 г. Антиовариальную цитотоксическую сыворотку (АОЦС) получали в результате трeхкратной иммунизации самцов кролей антигеном (солевыми экстрактами ткани яичника самок мышей) в возростающих дозах. Титр антител в цитотоксических сыворотках определяли реакцией связывания комплемента. Получено четыре антиовариальные цитотоксические сыворотки. Титр сыворотки, полученной путем их смешивания, составил: 1:320. Антиовариальные антитела (АОАТ — как суммарная гамма-глобулиновая фракция антиовариальной цитотоксической сыворотки) выделяли из АОЦС высаливанием. Аутоимунное повреждение яичников моделировали введением большой дозы АОАТ в хвостовую вену животных как опубликовано в [3]. Через 72 ч после инъекции АОАТ вводили препарат верапамила гидрохлорида ("Дарница", Украина): однократно внутривенно и внутрибрюшинно в дозах 0,2; 0,4; 0,7; 1,2; 2,5; 5,0 мг/кг и 0,7; 1,2; 2,5; 5,0 мг/кг, соответственно; 3-кратно с интервалом 48 ч внутривенно и внутрибрюшинно в дозах 0,7; 1,2; 2,5 мг/кг и 2,5; 5,0 мг/кг; 5-кратно с интервалом 24 ч внутривенно и внутрибрюшинно в дозе 1,2 мг/кг и 2,5 мг/кг. Контрольным животным вводили изотонический раствор NaCl в эквивалентном объеме. Использованые в эксперименте дозы верапамила соответствуют терапевтическим [8]. Через 24 ч после однократного введения и через 4 после третьего и пятого введения под эфирным наркозом животных умертвляли методом смещения шейных позвонков. Также через 72 ч после инъекции АОАТ вводили препараты блокаторов NOS: NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) и NG-монометил-L-аргинин (L-NMMA) однократно внутрибрюшинно в дозах: 0,70; 1,25; 2,50; 3,50 мг/кг. Через 20 ч после введення препаратов блокаторов NOS под эфирным наркозом животных умертвляли методом смещения шейных позвонков. Отпрепарированные яичники мыши переносили в культуральную среду (DМЕ D5405 "Sigma", США). Под микроскопом механически освобождали фолликулы от соединительнотканной основы кортикального вещества. И после прокола фолликула иголкой, в среду DМЕ выделяли ооцити без кумулюса (О). Освобождение О от гранулярных и кумулюсных клеток осуществлялось стеклянной пипеткой без помощи ферментов. Ооциты культивировали в камерах с 0,40 мл среды DМЕ с 15 ммоль/л HEPES и физиологической концентрацией Са++ (1,71 ммоль/л), при 37 °С, в стерильном боксе. Во всех случаях контрольные и тестированные клетки содержались в одинаковых условиях. Подсчитывали количество ооцитов, которые выделяли из яичника экспериментальных животных после введения препаратов блокаторов. Стадии созревания ооцитов оценивали таким образом: метафаза І — по четко сформированному зародышевому пузырьку (ЗП+); возобновление первого деление мейоза ооцитами — по определению момента растворения зародышевого пузырька (ЗП-); метафаза ІІ — по формированию ооцитами первого полярного тельца (ПТ). Вычисляли отношение количества ооцитов с (ЗП-) и (ПТ) к начальному количеству (ЗП+) ооцитов в процентах (% ЗП- и % ПТ). Для определения достоверности отличий между величинами групп данных использовали t-критерий Стъюдента. Результаты и их обсуждение Однократное введение большой дозы АОАТ вызывало: дозозависимое уменьшение количества ооцитов, которые выделяли из одного яичника, а именно, АОАТ в дозе 0,2 мг и 0,02 мг 7,7±1,5 шт/яичник (p<0,01) и 11,8±0,5 шт/яичник (p<0,01), соответственно, при 15,6±0,2 шт/яичник у контрольных животных; не возобновление мейоза ооцитов и дозозависимое уменьшение процентного соотношения ооцитов, которые возобновляли мейоз in vitro, к количеству ооцитов, которые продолжали сохранять состояние приостановленного мейоза % (ЗП-). Так, доза 0,2 мг АОАТ уменьшала % (ЗП-) до 6,2±0,1 % (p<0,01), доза 0,02 мг — до 14,8±0,9 % (p<0.01), при 38,2±2,1 % в контроле; после введеня АОАТ в дозе 0,2 мг — ни один ооцит не формировал первое полярного тельце после 18 ч культивирования (p<0,01), а доза 0,02 мг АОАТ уменьшала % (ПТ) до 21,9±0,9 % (p<0,01) при 50,4±0,8 % в контроле. Следовательно, имеет место угнетающее влияние большой дозы АОАТ на гаметогенез, что приводит к угнетению возобновления мейоза и формированию первого полярного тельца ооцитами в яичнике животных. 3-кратное внутрибрюшинное введение верапамила в дозе 1,2 мг/кг вызывало: уменьшение количества ооцитов, которые выделяли из одного яичника, до 12,6±1,3 (p<0,02), при 15,6±0,2 шт/яичник у контрольных животных. 5-кратное внутривенно введение верапамила в дозе 1,2 мг/кг и 5-кратно внутрибрюшинно в дозе 2,5 мг/кг вызывало уменьшение количества ооцитов, которые выделяли из одного яичника, до 10,5±1,1 (p<0,01) и 12,4±1,4 (p<0,01) при 15,6±0,2 шт/яичник у контрольных животных; а также уменьшение процентного соотношения ооцитов, возобновляющих мейоз % (ЗП-), а именно: 28,1±1,4 (p<0,01) и 30,5±1,7 (p<0,01), соответственно, при 38,2±2,1 % в контроле; после введеня верапамила % (ПТ) составил, соответственно, 42,5±1,4 (p<0,01) и 46,0±1,7 (p<0,05) после 18 ч культивирования при 50,4±0,8 % в контроле. Таким образом, нами получены данные относительно угнетающего эффекта блокатора кальциевых каналов верапамила на количество овариальных ооцитов, которые выделялись из одного яичника мышей, и на мейотическое созревание таких ооцитов в стандартных условиях для культивирования клеток in vitro. В наших опытах по изучению эффекта блокатора кальциевых каналов верапамила, при моделировании аутоимунного повреждения яичников у мышей с помощью однократного введения 0,02 мг АОАТ, при введении препарата блокатора однократно внутривенно в дозах 0,7–5,0 мг/кг и однократно внутрибрюшинно в дозах 1,2–5,0 мг/кг регистрировалось усиление угнетения созревания ооцитов in vitro (р<0,05, р<0,01); при введении препарата блокатора кальциевых каналов 3- и 5-кратно внутривенно в дозах 0,2–2,5 мг/кг и 3- и 5-кратно внутрибрюшинно в дозах 0,7–5,0 мг/кг — имеет место уменьшение количества ооцитов в яичнике и угнетение их созревания in vitro. Данные относительно проявления эффекта блокатора кальциевых каналов верапамила при моделировании аутоиммунного повреждения ячников у мышей представлены в табл. 1. Оксид азота (NO), свободнорадикальный газ с временем полужизни в биологических объектах порядка 5 сек, выполняет многочисленные функции в различных тканях [6; 8]. NO представляется и как важный внутриовариальный регуляторный фактор. Он синтезирован через NO синтазу (NOS), фермент цитозоля. Отмечено присутствие NOS изоформ и показано их клеточно-специфические вклады в яичнике млекопитающих. Индуцибильная NOS присутствует в лейкоцитах, эндотелиальная NOS — в цитоплазме овариальных и овулировавших ооцитов, в гранулярных клетках, нейрональная NOS в нервных клетках, ооцитах, клетках интерстиция [10, 12]. Результаты исследований разных ученых свидетельствует о том, что на начальных этапах развития аутоимунного повреждения важную роль в повреждении ткани выполняют активированные нейтрофилы, интенсивно генерирующие активные формы кислорода [1, 2]. Относительно участия в данном патологическом процессе системы генерации оксида азота и функционально тесно связанных с ней систем циклических нуклеотидов (особенно цГМФ), данные литературы противоречивы [9;11]. Возможно, что это обусловлено высокой активностью оксида азота относительно активных форм кислорода, что предполагает существования нескольких метаболитных путей, посредством которых оксид азота выступает промоутором или протектором повреждений, или же вызванное другими активными метаболитами кислорода [6]. В наших опытах однократное внутрибрюшинное введение L-NAME и L-NMMA в дозах от 0,7 мг/кг до 3,5 мг/кг вызывало: уменьшение количества ооцитов, которые выделяли из одного яичника, до 12,0±1,0 шт/яичник p<0,01 и 12,8±1,4 шт/яичник p<0,02 для дози 3,5 мг/кг L-NAME и L-NMMA, соответственно, при 15,6±0,2 шт/яичник у контрольных животных; увеличение количества ооцитов с атипичными морфометричными признаками до 17,8 % и 14,7 % для дози 3,5 мг/кг L-NAME и L-NMMA, соответственно, при 3,3 % у контрольных животных (табл. 2). Таким образом, нами установлен угнетающий эффект блокаторов nos на количество ооцитов в яичнике и на состояние мейотического созревания овариальных ооцитов мышей. В опытах по изучению эффекта блокаторов NOS (табл. 3) при моделировании аутоиммунного повреждения яичников у мышей при введении препаратов однократно внутрибрюшинно в дозах 1,25 мг/кг (l-name ) и 2,50 мг/кг (l-nММА) регистрировалось усиление угнетения созревания ооцитов in vitro. Таким образом, наши данные и данные литературы [5; 7] дают возможность утверждать, что химиотерапия с использованием блокаторов кальциевых каналов в наше время достигла уровня, позволяющего сформулировать проблему стерильности или бесплодия, как следствие влияния препаратов блокаторов кальциевых каналов на ткани репродуктивных органов. В условиях "кризиса здоровья и смертности" мы подтверждаем угрозу возростания стерильности или бесплодия в человеческой популяции, как следствие действия препаратов блокаторов кальциевых каналов, которые широко используются при лечении различных заболеваний, к примеру, сердечно-сосудистых, на ткани репродуктивных органов. Установлено, что значительно меньшее количество ооцитов, которые выделялись из одного яичника мышей, которые притерпевали вплияние блокаторов NO-синтазы, были в профазе І — в нормальной стадии мейоза для не овулировавших ооцитов и у значительно большего числа ооцитов выявляли атипичную морфологию, в сравнении с ооцитами мышей с аутоимунным повреждением яичников. Результатами показано, что овариальная NО-синтаза необходима для обеспечения максимальной овуляции, а отсутствие NO во время преовуляторного периода приводит к значительным нарушениям в мейотическом созревании ооцитов. Такой дефицит продукции NO овариального происхождения может внести вклад в формирование проблемы стерильности самок. Литература |