УДК 615.241.3:547.965]: 615.244

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГИПОАММОНИЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ L-АРГИНИНА L-ГЛУТАМАТА ПРИ ПОДОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ АММОНИЯ ХЛОРИДОМ

Ю.В. Меркулова, Л.А. Чайка, к.м.н., О.Н. Гомон, к.б.н., Л.И. Белостоцкая, к.б.н.

Государственный научный центр лекарственных средств, г. Харьков

Гипераммониемия (ГА), возникающая примерно у 60 % пациентов с заболеваниями гепатобилиарной системы, а также как следствие массивных кровопотерь, эклампсии, отека легких, гипертермии различного генеза, врожденных и наследственных энзимопатий цик-ла синтеза мочевины, приводит к развитию печеночной энцефалопа-тии и ее крайних проявлений — прекомы и комы, при которых летальность достигает 34–82 % [1].

В настоящее время за рубежом для лечения гипераммониемии используют моно- и комбинированные препараты на основе аминокислот — аргинина (в виде аргинина гидрохлорида), орнитина, глутаминовой и аспарагиновой кислот. Высокая гипоаммониемическая эффективность данных аминокислот обусловлена их регулятор-ными свойствами, как активаторов ферментов реакций обезврежива-ния аммиака, и метаболическими свойствами, как непосредственных участников этих реакций в качестве субстратов [2].

В исследованиях, проведенных нами ранее, было показано, что синтезированная в ГНЦЛС в сотрудничестве с ГЭЗНП ИБОНХ НАН Украины соль аргинина и глутаминовой кислоты — L-аргинина L-глутамат при остром отравлении животных аммония ацетатом в дозе ЛД₅₀ повышает выживаемость мышей на 88 %, снижает уровень аммиака в крови и мозге и повышает содержание мочевины в сыворотке крови крыс [3,4], при остром отравлении крыс четыреххлористым углеродом стимулирует процессы мочевинообразования [5].

Целью настоящих исследований явилось изучение гипоаммониемической активности L-аргинина L-глутамата в условиях подострой интоксикации аммония хлоридом (NH4Cl). Особенностью этой модели является то, что наряду с существенным повышением уровня аммиака в крови и мозге животных, у них развивается также нарушение кислотно-основного равновесия крови в сторону ацидоза [6, 7]. Следовательно, эта модель весьма информативна поскольку ГА и ацидоз нередко сочетаются при ряде заболеваний у человека. В качестве препаратов сравнения использовали смесь индивидуальных аминокислот — аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты.

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на 26 белых нелинейных крысах обоего пола массой 200–256 г, которые были разделены на 4 группы. Проводили предварительный отбор животных, которые потребляли при контрольных замерах примерно равное количество питья; 1-я группа — контроль интактный, 2-я группа — контроль на патологию, 3-я группа — опыт, животные, отравленные аммония хлоридом и получавшие смесь аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты; 4-я группа — опыт, то же, что и группа 3, но получавшие L-аргинина L-глутамат.

Гипераммониемию вызывали 0,28 М (1,5 %) раствором хлорида аммония на питьевой воде, которую крысы получали в течение 7 дней при доступе к воде ad libitum [7]. Суточные дозы NH₄Cl, рассчитанные по объему питья, потребляемого каждой крысой в течение 7 сут, составили 612–694 мг/кг, или в среднем 650 мг/кг/сутки. С целью корректности учета потребляемого питья каждую из крыс содержали индивидуально в течение 7 дней эксперимента.

L-аргинина L-глутамат вводили внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг (по аминокислотным остаткам) в виде водного раствора в течение 5 дней, начиная с третьего дня затравки животных аммония хлоридом. Выбранная доза рассчитана согласно рекомендаций по определению равноэффективных доз для животных и человека исходя из количества лекарственного препарата на поверхность тела [8] и соответствует терапевтической дозе для человека гипоаммониемического препарата "Глутарзин" ("Berlin-Chemie", Германия)[9], представляющего собой смесь аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты. Эксперименты, проведенные нами ранее [3, 4], подтвердили справедливость указанных расчетов, показав, что в этой дозе L-аргинина L-глутамат обладает выраженной гипоаммониемической активностью.

Смесь аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты (217,3 мг и 182,7 мг соответственно) вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора в дозе 400 мг/кг (по аминокислотным остаткам) по той же схеме, что и исследуемую субстанцию L-аргинина L-глутамата.

Крыс декапитировали на 8-й день от начала затравки, определяли массу тела, массу правой почки до и после высушивания, рассчитывали массовый коэффициент влажной (нативной) и сухой правой почки. Определяли в крови содержание мочевины с помощью наборов (фирма "Лахема", Чехия), уровень аммиака с помощью наборов (фирма "Sentinel CH.", Италия). В связи с тем, что на фоне ГА, вызванной аммония хлоридом, нарушается также кислотно-основное состояние крови со сдвигом рН в кислую сторону, определяли щелочной запас цельной крови (ЩЗЦК) и ее рН. рН цельной крови регистрировали, рассчитывая разность между рН смеси (0,2 мл цельной крови + 10 мл 0,01 N НСl) и рН 0,01 N соляной кислоты (2,10). Затем в данной смеси определяли ЩЗЦК методом титрования NaOH [10].

Статистическую обработку результатов исследований проводи-ли с использованием критерия Стьюдента, оценивая вероятность полученных результатов на уровне значимости не менее 95 % (р < 0,05).

Результаты и их обсуждение

Крысы, отобранные в каждую из 4-х экспериментальных групп, до начала затравки аммония хлоридом потребляли примерно равное количество воды, составившее в сутки 11,0–13,9 мл. После начала затравки потребление питья во всех группах, кроме интактной, снизилось примерно в равной степени, составив 7,1–8,3 мл в сутки (табл. 1). В контрольной группе интактных животных объем ежесуточно потребляемого питья сохранился на уровне исходных значений.

У животных контрольной нелеченой группы к 8-му дню эксперимента на фоне тенденции к снижению прироста массы тела и возрастанию массы почек, существенно (на 44 %) повышается их массовый коэффициент (табл. 1, рис.). В то же время массовый коэффициент сухой почки сохраняется неизменным относительно нормы, что позволяет предположить развитие у нелеченых крыс nh₄cl-индуцированного гидронефроза.

У этих же крыс регистрируется выраженная гипераммониемия, сопровождающаяся повышением в 2 раза сравнительно с физиологической нормой уровня аммиака, что является закономерным следствием поступления больших количеств экзогенного аммиака при 7-дневной затравке NH₄Cl (табл. 2).

Поступление в перипортальные гепатоциты избытка аммиака вызывает активацию цикла уреогенеза и повышение образования конечного продукта этого цикла — мочевины [11]. О повышении интенсивности важнейшего аммиакнейтрализующего процесса — цикла синтеза мочевины — свидетельствует возрастание в 1,5 раза содержания мочевины в крови у нелеченых крыс.

У тех же крыс к 8-ому дню эксперимента достоверно снижается ЩЗЦК. Снижение запаса буферных оснований крови подтверждается также тенденцией к уменьшению степени нейтрализации 0,01 N раствора HCl при добавлении цельной крови нелеченых животных, что, очевидно, связано, со смещением рН крови в кислую сторону в процессе развития NH₄Cl-индуцированного ацидоза (табл. 3).

Эти результаты согласуются с данными других авторов о снижении ЩЗЦК при введении NH₄Cl, обусловленном уменьшением емкости бикарбонатной буферной системы крови [7]. Как полагают, механизм наблюдаемого нарушения кислотно-основного баланса крови обусловлен свойствами аммония хлорида как кислотообразующего агента, который, легко всасываясь из желудочно-кишечного тракта, метаболизируется с образованием соляной кислоты, избыточное содержание которой является причиной развития некомпенсированного ацидоза [12]. Кроме того, длительное введение аммиака вызывает избыточное накопление молочной кислоты в крови, приводя к развитию лактат-ацидоза [13].

Полученные в настоящих экспериментах данные свидетельствуют, что при отравлении NH₄Cl уровень мочевины в сыворотке возрастает относительно меньше, чем, при отравлении другими солями аммиака [14–16]. Вероятно, вызванное аммония хлоридом, как кислотообразующим агентом, смещение рН крови в кислую сторону снижает каталитическую активность в перипортальных гепатоцитах рН-зависимых ферментов — глутаминазы и митохондриальной карбоангидразы V, что приводит к частичному ингибированию мочевинообразования. Таким образом, относительно незначительное повышение мочевинообразования при NH₄Cl-отравлении можно рассматривать как функционирование биохимического компенсаторного механизма, при котором процесс уреогенеза регулируется как скоростью поступления субстрата, так и кислотно-основным состоянием организма.

Таким образом, у крыс, получавших в течение 7 дней аммония хлорид, развивается ГА, снижается щелочной резерв и развивается гидронефроз, наблюдается тенденция к снижению рН крови и прироста массы тела.

Лечение L-аргинина L-глутаматом способствует нормализации прироста массы тела, что является одним из свидетельств антитоксического действия препарата (табл. 1, рис.). Наряду с этим, тенденция к снижению массы тела у животных при подостром отравлении аммиаком может быть также обусловлена прямым действием иона аммония на кортикальные области мозга, регулирующие аппетит [6]. Учитывая эти данные, можно полагать, что нормализация прироста массы тела у леченных крыс является результатом аммиаксвязывающей активности l-аргинина l-глутамата.

L-аргинина L-глутамат предотращает также отек ренальных тканей, о чем свидетельствуют такие показатели, как масса нативных и сухих почек, которые сохраняются на уровне интактных животных, а массовый коэффициент нативной почки достоверно меньше, чем у нелеченых крыс (табл. 1, рис.).

Лечение L-аргинином L-глутаматом на 30 % уменьшает гипераммониемию, достоверно снижая концентрацию аммиака в крови по сравнению с нелеченой патологией (табл. 2). Гипоаммониемический эффект l-аргинина l-глутамата, составив 59 %, очевидно, в первую очередь, связан с повышением мощности основного аммиакнейтрализующего процесса печени — цикла мочевинообразования. Подтверждением этому является увеличение относительно интактного контроля на 83 % уровня мочевины — конечного продукта уреогенеза (табл. 2).

Как видно из данных, представленных в табл. 3, терапия крыс l-аргинина l-глутаматом, несколько ослабляя ацидотические явления, способствует сохранению ЩЗЦК, который статистически достоверно не отличается от уровня в интактной группе.

Препарат сравнения — смесь аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты не только тормозит повышение массы тела у животных с патологией, но и приводит к ее снижению в среднем на 300 мг/сутки (табл. 1, рис.).

У животных, леченных препаратом сравнения, явления гидронефроза усугубляются: масса нативной почки возрастает по сравнению с интактными крысами на 48 %, что несколько больше, чем у нелеченого контроля. Статистически достоверно относительно интактных животных и леченных L-аргинином L-глутаматом возрастает массовый коэффициент нативной почки.

Смесь аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты, в отличие от их соли, проявляет лишь тенденцию к снижению на 25 % концентрации аммиака в плазме крови относительно нелеченого контроля. Эффективность аминокислотной смеси в отношении уровня мочевины достоверно ниже, чем L-аргинина L-глутамата (табл. 2).

Введение аминокислотной смеси не предотвращает также снижения ЩЗЦК, который в этой группе достоверно ниже, чем в интактном контроле. Эффект при лечении смесью аминокислот был ниже в 1,7 раза, чем L-аргинина L-глутамата, составив 35 % (табл. 3). Возможно, это обусловлено тем, что аргинина гидрохлорид относится к кислотообразующим (окисляющим) солям [16], которые, так же как и аммония хлорид и лизина гидрохлорид, могут являться причиной экзогенного ацидоза с повышением концентрации Сl^- [17].

По-видимому, более высокий аммиакнейтрализующий эффект аминокислотной соли (L-аргинина L-глутамата) в сравнении с фармакотерапией индивидуальными аминокислотами, можно объяснить, исходя из современных представлений о механизмах регуляции и взаимосвязи процессов обезвреживания аммиака и поддержания кислотно-основного гомеостаза [6].

Как известно, обезвреживание аммиака в цикле синтеза мочевины требует его конденсации с ионом бикарбоната, в результате чего образуется карбамоилфосфат. Однако, при смещении рН в кислую сторону повышается потребность в бикарбонатном ионе как важнейшем компоненте буферной системы крови, который связывает избыточные количества водородных ионов крови с образованием слабо диссоциирующей угольной кислоты [17]. Это является одной из причин снижения мочевинообразования при ацидозе [6], в том числе и в условиях настоящего эксперимента. На фоне угнетения уреогенеза возрастает роль глутаминсинтетазной реакции нейтра-лизации аммиака. Для повышения мощности этой реакции необходимо дополнительное поступление субстрата — глутаминовой кислоты.

L-аргинина L-глутамат в результате субстратной индукции активирует глутаминсинтетазную реакцию, связывая аммиак в нетоксичный глутамин. Глутамин с кровью поступает в почки, где является основным поставщиком NH₄⁺ для процессов аммониогенеза. Благодаря повышению аммониогенеза из организма выводится избыток Н⁺ ионов и нормализуется кислотно-основное состояние крови. Одновременно, L-аргинина L-глутамат стимулирует обезвреживание аммиака в цикле синтеза мочевины.

Кроме того, L-аргинина L-глутамат, будучи глутаматсодержащим соединением, может препятствовать развитию аммиакиндуцированного лактатацидоза [18]. Известно, что глутаминовая кислота способствует увеличению концентрации a-кетоглутарата с последующим накоплением в тканях щавелевой кислоты. Это создает условия для вовлечения в цикл Кребса молочной кислоты и других недоокисленных продуктов [19]. Так, в эксперименте на животных с метаболическим ацидозом инфузия глутаминовой кислоты в виде глутамината натрия способствует снижению содержания кислых продуктов в крови и повышению рН [20], нормализуя показатели метаболического и респираторного ацидоза [21]. Клинические исследования подтверждают, что глутаминовая кислота оказывает выраженное нормализующее влияние на состояние кислотно-щелочного равновесия, ликвидируя респираторный ацидоз, обусловленный альвеолярной гиповентиляцией, которая приводит к гиперкапнии [22].

Очевидно, реализация аммиакнейтрализующих эффектов L-аргинина L-глутамата в условиях гипераммониемии и ацидоза способствует сохранению кислотно-щелочного гомеостаза организма. Механизм гипоаммониемического действия смеси аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты и L-аргинина L-глутамата сходны. Однако, на фоне NH₄Cl-индуцированного снижения щелочного резерва крови избыточное поступление в организм носителя Cl^- — аргинина гидрохлорида, который обладает кислотообразующими свойствами, может усугублять патологию и провоцировать развитие гиперхлоремического ацидоза. Это может являться причиной усиления конкурентных взаимоотношений между циклом мочевинообразования и буферными системами крови в отношении бикарбонатных ионов, в результате чего эффективность применения смеси аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты как гипоаммониемического лекарственного средства снижается.

Выводы:

1. В условиях гипераммониемии и нарушения кислотно-щелочного состояния, вызванных подострой интоксикацией аммония хлоридом, L-аргинина L-глутамат оказывает выраженный гипоаммониемический эффект, снижая в 1,4 раза уровень аммиака в крови.

2. Терапия L-аргинина L-глутаматом способствует активации цикла мочевинообразования, восстановлению кислотно-основного баланса, повышая буферную емкость щелочного резерва крови, предотвращая гидронефроз и нормализуя прирост массы тела.

3. Фармакологические эффекты L-аргинина L-глутамата достоверно выше по сравнению с активностью смеси индивидуальных аминокислот — аргинина гидрохлорида и глутаминовой кислоты.

4. Проведенные экспериментальные исследования свидетельствуют о целесообразности создания на основе L-аргинина L-глутамата лекарственного средства для терапии гипераммониемии.

Литература
1. Надинская М.Ю. Печеночная энцефалопатия (Обзор литературы) // Российский журнал гастроэнтералогии, гепатологии, колопроктологии. —1998. —N 2. —С. 25–32.
2. Mawal YR. Rama Rao KV. Qureshi IA. Restoration of hepatic cytochrome c oxidase activity and expression with acetyl-L-carnitine treatment in spf mice with an ornithine transcarbamylase deficiency // Biochemical Pharmacology. —1998. —V. 55, N 11. —P. 1853–1860.
3. Меркулова Ю.В., Гомон О.Н., Чайка Л.А., Белостоцкая Л.И. Влияние оксида азота на антитоксические свойства аргинина глутамата при гипераммониемии // Тез. докл. VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Москва: РЦ "Фармединфо", 2000. —С. 522–523.
4. Merkulova Yu., Chaika L., Gomon O., Belostotskaya L. Efficiency of L-glutamate-L-arginine and L-ornithine-L-aspartate in the therapy of acute hyperammonemia in the rats // Fundamental & Clinical Pharmacology. —1999. —V. 13, Suppl. 1. —P. 311.
5. Чайка Л.А., Вертяева О.Н., Белостоцкая Л.И., Меркулова Ю.В., Шостенко Ю.В., Шеин А.Т. Антитоксический и гепатопротекторный эффект соли аргинина и глутаминовой кислоты // Тез. докл. IV Российского национального конгресса "Человек и лекарство". Москва: РЦ "Фармединфо". —1997. —С. 184.
6. Ammonia (Environmental Health Criteria 54 // Geneva: World Health Organization. —1986. —210 p.
7. Lotspeich W.D. Renal hypertrophy in metabolic acidosis and its relation to ammonia excretion // Amer. J. Physiol. —1965. —V. 208, N 6. —P. 1135–1142.
8. Владимиров В.Г. Расчет количества лекарственных препаратов на поверхность тела как один из способов определения равноэффективных доз для животных и человека // Фарм. и токсикология. —1976. —T. 9, N 1. —С. 123–128.
9. Лекарственные препараты: Книга 2./ Под ред В.Н.Коваленко —К.: Морион ЛТД, 1996. 464 с.
10. Сезова Н.П., Крони П.К. К методике определения щелочного запаса цельной крови // Вопросы фтизиатрии в Забайкалье. —1972. —Вып. 8. —С. 23–28.
11. Meijer A. J., Lamers W. H., Chamuleau R. A. F. M. Nitrogen metabolism and ornitine cycle function // Physiol. Rev. —1990. —V.7. —P. 701–748.
12. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В двух томах. Т. 2. —Изд. 13-е, новое. —Харьков: Торсинг. —1997. —592 с.
13. de Knegt RJ., Groeneweg M., Schalm SW. et all. Encephalopathy from acute liver failure and from acute hyperammonemia in the rabbit // Liver. —1994. —V. 14, N 1. —P. 25–31.
14. Руководство по клинической и лабораторной диагностики / Ч.3. Клиническая био-химия / Под ред. М.А.Базарновой, В.Т.Морозовой // К.: Вища шк. Головное изд-во, 1986. —279 с.
15. Cooper J.L. Ammonia metabolism in normal and portacaval-shunted rats // Enpex. med. and biol. —1990. V. 272. —P. 23–45.
16. Горн М. М, Хейтц У.И., Сверингер П.Л. Водно-электролитный и кислотно-основной баланс (краткое руководство). —СпБ. —М.: "Невский Диалект" — "Издательство БИНОМ". —1999. —320 с.
17. Жалко-Титаренко В.Ф. Водно-электролитный обмен и кислотно-основное состояние в норме и при патологии. —Киев: Здоровья. —1989. —200 с.
18. de Knegt RJ., Schalm SW., van der Rijt CC. et all. Extracellular brain glutamate during acuye liver failure and during acute hyperammonemia simulating acute failure: an experimental study based on vivo brain dialysis // J. of Hepatology. —1994. —V. 20, N 1. —P. 19–26.
19. Горчакова Н.А. Фармакология глутаминовой кислоты и ее соединений // Фармакол. и токсикол. —1990. —Вып. 25. —С. 10–17.
20. Баскович Г.А. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты в комплексном лечении циркуляторной гипоксии // Патологическая физиол. и эксперимент. терапия. —1978. —Вып. 1, N 1. —С. 20–25.
21. Глотов Н.А., Новоселова Н.Г., Шишов В.И. Состояние окислительных процессов в митохондриях печени и сердца и терапевтическое действие глутамата и сукцината при остром отравлении этанолом / Тез. конф. "Физиология вегетативной нервной системы", г. Куйбышев, декабрь 1979, Т.1. —Куйбышев. —1979. —С. 138–139.
22. Маевский Е.И., Шишов В.И., Новоселова Н.Г. и др. Некоторые патогенетические подходы к лечению острого отравления / Научн. тр. Иркутст. мед. ин-та. —1975. —Вып. 127. —С. 114–116.