|
МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 577.1.615 ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРА ГИБЕЛИ ТИМОЦИТОВ КРЫС, ВЫЗВАННОЙ РАЗЛИЧНЫМИ КСЕНОБИОТИКАМИ Т.О. Кишко, Н.П. Дмитренко, д.б.н., Ю.И. Лобода, д.б.н. Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, г. Киев Использование различных типов клеток в качестве объектов для изучения в опытах in vitro токсического действия ксенобиотиков получает все большее распространение. Оно оправдано с моральной точки зрения, так как позволяет значительно уменьшить расход животных в эксперименте и зачастую предоставляет большие возможности в обеспечении точности и воспроизводимости получаемых результатов, а также в проведении скрининга и выяснении избирательности действия ксенобиотиков [1]. Для изучения цитотоксического действия ксенобиотиков особенно подходящими представляются тимоциты. Эти клетки, по сравнению с другими типами клеток, легко выделяются, морфологически относительно однородны и более чувствительны к различным повреждающим воздействиям химических и физических факторов, под влиянием которых гибнут по типу апоптоза [2]. Известны многочисленные исследования, посвященные характеру и механизму гибели тимоцитов при действии тех или иных химических соединений [3–8]. Однако данные по сравнительному изучению дозовых зависимостей влияния различных ксенобиотиков in vitro на характер гибели тимоцитов в литературе отсутствуют. В связи с этим целью даной работы было проведение таких исследований с использованием различных ксенобиотиков (канцероген N-нитрозодиметиламин, фунгицид глифосат, фармакологические препараты папаверин и дексаметазон, а также этанол). Материалы и методы исследования Исследования проводили на крысах линии Вистар массой тела 150–170 г. Тимоциты выделяли в среде Хэнкса, содержащей 10 мМ трис-НСІ (pH 7,3). Клетки инкубировали в 24-луночном пластиковом планшете при 37°С в указанной среде с 5 %-ной эмбриональной инактивированной сывороткой плода теленка в концентрации 1•107 клеток на 1 мл в течение 7 часов. Количество мертвых и живых клеток определяли с помощью окрашивания трипановым синим и подсчитывали в камере Горяева. N-нитрозодиметиламин (НДМА), папаверин, дексаметазон, глифосат и этанол добавляли к суспензии клеток в среде Хэнкса в различных концентрациях. Результаты и их обсуждение На рис. 1–3 представлены кривые гибели тимоцитов в зависимости от времени их инкубации в среде, содержащей различные концентрации ксенобиотиков. Из них видно, что тимоциты начинают гибнуть не сразу, а через определенный латентный период, который составляет около 3-х часов (для дексаметазона, папаверина и НДМА). При дальнейшей инкубации тимоцитов наблюдается увеличение числа погибших клеток. Кривые, описывающие динамику гибели тимоцитов во времени, для всех исследуемых эффекторов, кроме этанола, при различных дозах имеют сложный характер и в определенной степени приближаются к сигмоидальному типу. После латентного периода увеличение числа мертвых клеток происходит вначале медленно, затем ускоряется и на 5–7-ой ч инкубации клеток оно замедляется. С увеличением концентрации исследуемых веществ и времени инкубации характер кривых гибели клеток существенно не меняется. Так, отношение количества мертвых клеток на 3-й час к таковому на 7-й час инкубации изменяется незначительно. Этанол отличается от других исследованых соединений тем, что под его влиянием увеличение гибели тимоцитов происходит линейно. Интересно, что при меньших концентрациях спирта в среде (0,5 % и 1 %) тимоциты начинали гибнуть после 4 ч инкубации, а при больших его концентрациях(2 %–5 %) латентный период укорачивался до 2 ч, т.е. почти в 2 раза (рис. 2б). Наличие значительного латентного периода, предшествующего началу гибели клеток, а также замедление скорости их гибели к 5–7 ч инкубации указывает на то, что тимоциты при действии исследуемых химических соединений гибнут по типу апоптоза. Это подтверждают и данные других исследователей, изучавших влияние дексаметазона, НДМА и этилового спирта на тимоциты [5–8]. Анализ кривых концентрационных зависимостей гибели клеток (рис. 4) позволяет выявить ряд особенностей. Так, при действии дексаметазона кривая состоит из 2-х прямых, имеющих различный наклон. При увеличении концентрации дексаметазона до 0,2 мМ число мертвых тимоцитов нарастает более стремительно, чем при дальнейшем ее повышении. При максимальной концентрации дексаметазона (0,6 мМ) гибнет 60 % клеток. Это указывает на наличие двух, отличающихся по своей чувствительности к цитотоксическому действию дексаметазона, популяций тимоцитов, очевидно, относящихся к иммунонекомпетентным корковым тимоцитам, которые составляют более 90 % всех клеток тимуса [2]. Кривые с одним выраженным изломом, указывающие на то, что тимоциты по чувствительности к исследуемому соединению делятся по крайней мере на две субпопуляции, характерны также для НДМА и глифосата (рис. 4). Но если более чувствительная субпопуляция тимоцитов в отношении НДМА составляет около 34 %, то для глифосата 69 % от общего количества погибших клеток. Дозовая зависимость гибели тимоцитов от воздействия папаверина выражается кривой более сложного характера, имеющей две точки перегиба, наличие которых обусловленно тем, что в интервале концентраций 0,15–2,0 мМ увеличение количества мертвых клеток происходит более интенсивно, чем при других исследуемых концентрациях (рис. 4). Отсюда следует, что имеется по крайней мере три субпопуляции с неодинаковой чувствительностью к цитотоксическому действию папаверина. Наконец, концентрационная зависимость гибели тимоцитов под влиянием этанола (рис. 4) демонстрирует однородность реакции клеток на это соединение. Недавно показано [9], что чувствительность тимоцитов к тому или иному ксенобиотику может зависеть не только от его субпопуляционной разновидности, но и от фазы клеточного цикла, в которой они находятся. Тимоцитарная модель является удобной и для оценки комбинированного цитотоксического действия ксенобиотиков. Так, в суспензии содержащей 0,06 мМ глифосата на 7-ой ч инкубации гибло 31,0±3,5 % (n=6). В суспензии клеток, содержащей 0,007 мМ НДМА, к 7 ч число погибших клеток составляло 12,1±1,3 % (n=6). При совместном действи 0,007 мМ НДМА и 0,06 мМ глифосата происходит суммация их цитотоксических эффектов и к 7 ч инкубации число погибших клеток достиго 42,8±4,1 % (n=6). Таким образом, тимоциты являются удобным объектом для количественной оценки особенностей цитотоксического действия ксенобиотиков и их комбинаций в опытах in vitro. Использование субпопуляций тимоцитов, фракционированных с помощью физических и иммунологических методов, позволит расширить возможности такой оценки. Литература |