УДК 577.158.4;616.099,615.9

ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ И КАТАБОЛИЗМ L-АЛАНИНА И L-ГЛУТАМАТА У КРЫС В УСЛОВИЯХ ЗАМКНУТОГО ПРОСТРАНСТВА

Сарр Сандене, А.Я. Розанов, д.б.н., проф.

Одесский государственный университет им. И.И. Мечникова, Украина

Успехи нейрохимии определили новые подходы использования при различных видах гипоксии аминокислот, которые являются не только предшественниками нейротрансмиттеров, но и источником энергии при гипоксии головного мозга [1, 2], а также обладают многими другими функциями. В частности, метиловый эфир L-аланина расширяет кровеносные сосуды, освобождая в эндотелии NO [3], d-аминовалериановая кислота и глицил-глицин обладают противосудорожным действием [4].

В качестве антигипоксических препаратов на основе аминокислот в медицине используются калий-магниевые соли L-аспартата, g-аминобутират и его конъюгаты с никотиновой кислотой [5, 6]. Смеси аминокислот для парэнтерального введения, в частности содержащие аланин, глутамат и лейцин, используются в клинической практике при стрессовых состояниях [7], однако эффективность компонентов при гипоксии в эксперименте не оценена. Показано защитное действие аспартата и триптофана совместно с гистидином при гиперкапнической и гипобарической гипоксии [8, 9], N-ацетиласпартата и N-ацетилглутамата при гипотермии [10]. Антигипоксическое действие аспартата и глутамата очевидно, однако парентеральное их применение на практике ограничено побочным действием, в частности повреждением нейронов некоторых отделов головного мозга, особенно при передозировке [11].

Среди различных видов гипоксий различают субстратные (недостаточное поступление в митохондрии аминокислот, глюкозы, жирных кислот и кислорода), ферментные (связанные с нарушением структуры и функции ферментных систем тканевого дыхания), а также токсические [12–14]. Все виды гипоксии имеют сложный генез, в эксперименте используют гипобарию или моделируют гипоксию газовыми смесями, чаще всего содержащими избыток N₂ и СО₂ при недостатке О₂, однако во всех случаях причиной смерти является гипоксия чувствительных к недостатку кислорода клеток головного мозга [13]. Заслуживает внимания модель гиперкапнической "гипоксии замкнутого пространства" (ГЗП), как наиболее часто встречающейся в практике (землетрясения, завалы в шахтах и др.). ГЗП используется в аэрокосмической медицине для тренировок и отбора космонавтов и при скрининге антигипоксантов. При ГЗП на организм действуют гиперкапния, накопление аммиака, формальдегида и других токсических и летучих метаболитов в гермокамере.

Целью работы являлось исследование защитного действия L-аланина и L-глутамата при ГЗП и некоторых возможных его механизмов.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили белые крысы самцы линии Вистар с массой тела 180–220 г, содержавшиеся на стандартном рационе вивария. Крыс исследовали в утренние часы и за 1 ч до опыта не кормили. Животных помещали в герметические индивидуальные камеры объемом 1066 см³ и регисрировали продолжительность жизни животных до времени наступления последнего агонального вдоха с точностью 15–20 секунд. Повышение температуры в гермокамерах было незначительным — до 28 °С.

Испытывали антигипоксическое действие L-аланина (ч.д.а. "Реахим") и L-глутамата (хроматографически чистый "Реахим"), которые вводили подкожно в дозе 2,0 ммоль/кг в виде мононатриевых солей в объеме 1,0 мл на 100 г массы тела (0,2 М растворы, предварительно нейтрализованные NaHCO₃ до рН 7,2–7,4) за 2 мин до помещения животных в гермокамеру. Контрольным живот-ным вводили соответствующий объем физиологического раствора натрия хлорида.

Катаболизм до ¹⁴СО₂ меченых по a-карбоксилу 1-[¹⁴C]-L-аланина и 1-[¹⁴C]-L-глутамата с удельной радиоактивностью 2,16–2,18 Гбк•ммоль^-1 (фирмы "Amersham") гомогенатами полушарий головного мозга определяли при конечной концентрации меченых аминокислот в инкубационной среде (ИС) 0,1 мМ–0,8 мМ при рН 7,2 (K,Na-фосфатный буфер 0,06 М) и температуре 37 °С. Выделяющийся ¹⁴СО₂ улавливали специальным фильтром-поглотителем в инкуба-ционных сосудиках при перемешивании [15]. Скорость катаболизма меченых аминокислот рассчитывали в нмолях выделяемого ¹⁴СО₂ на г^-1 ткани•мин^-1. Определение максимальной и эндогенной глутаматдекарбоксилазной (ГДК) активности в головном мозге определяли хроматографическим методом [16] и выражали образовавшейся ГАМК в 1 мин на 1 г ткани в мкмолях. Результаты исследований обрабатывали статистически [17, 18].

Результаты и их обсуждение

Животных исследовали через 20 мин после помещения в гермокамеру, когда наблюдаются только признаки беспокойства ("стрессовая фаза"), и в агональном состоянии (35–45 мин). После декапитации извлекали головной мозг, снимали мягкую мозговую оболочку и исследовали полушария головного мозга. При изучении катаболизма до ¹⁴СО₂ в ИС добавляли меченые аминокислоты в концентрациях, близких к содержанию в головном мозге L-аланина, без добавления коферментов, а при исследовании активности ГДК также с добавлением пиридоксаль-5-фосфата (ПАЛФ).

Результаты исследований (табл. 1) показали, что в первый "стрессовый" период действия факторов замкнутого пространства в полушариях головного мозга значительно увеличивается катаболизм до ¹⁴СО₂ меченых по a-карбоксилу l-аланина и l-глутамата, а в агональном состоянии — достоверно снижается по сравнению с контролем при всех исследуемых концентрациях меченых аминокислот. Следует отметить, что при такой постановке экспериментов возможно учесть увеличение скорости катаболизма до ¹⁴СО₂ в первую стрессовую фазу ГЗП (20 мин) и определить те конечные их концентрации, при которых это увеличение достоверно. Эти оптимальные концентрации меньше исходного содержания l-аланина и особенно l-глутамата в головном мозге и близки к содержанию в нем субстратов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК).

При низких концентрациях субстратов (0,1 и 0,2 мМ) скорость катаболизма до ¹⁴СО₂ 1-[¹⁴C]-L-аланина и 1-[¹⁴C]-L-глутамата гомогенатами полушарий головного мозга одинакова и только при больших концентрациях (0,2 и 0,4 мМ) наблюдается достоверное увеличение скорости катаболизма до ¹⁴СО₂ меченого по a-карбоксилу L-глутамата по сравнению с L -аланином.

Скорость катаболизма до ¹⁴ СО₂ меченых аминокислот возрастает с увеличением их концентрации в инкубационной среде, что позволило рассчитать кажущуюся V_max по координатам Лайнуивера-Бэрка для 1-[¹⁴C]-глутамата, которая составила 1250 нмоль/мин на 1 г головного мозга нормальных крыс [15].

Таким образом, эти исследования показали, что скорость метаболизма до ¹⁴СО₂ меченых по a-карбоксилу L-аланина и L-глутамата возрастает с увеличением их концентрации в инкубационной среде. Из этого можно полагать, что допольнительное поступление исследуемых аминокислот из крови в головной мозг после введения в терапевтических дозах может увеличить потребление их головным мозгом в качестве источника энергетических субстратов. Можно также предполагать,что эти аминокислоты переаминируются до пирувата и a-кетоглутарата и используются в ЦТК по аминоферазному пути метаболизма [1].

Однако, L-глутамат, введенный в терапевтической дозе (2,0 ммоль/кг или 294 мг/кг), может подвергаться в головном мозге прямому декарбоксилированию под влиянием ГДК.

Поэтому в следующей серии экспериментов мы определяли активность ГДК при действии факторов замкнутого пространства (табл. 2).

Результаты исследований показали, что активность ГДК в полушариях головного мозга крыс достаточно стабильна к действию кофактора, концентрации субстрата in vitro и к влиянию ГЗП. В частности, "максимальная" активность ГДК в полушариях головного мозга крыс, выявляемая при избытке ПАЛФ и субстрата (212±9,7 нмоль•мин^-1•г^-1), только на 22 % выше, чем активность "эндогенной" ГДК. Это свидетельствует о достаточном содержании ПАЛФ и L-глутамата в исходных гомогенатах и о малой чувствительности ГДК к избытку субстрата. При действии ГЗП "максимальная" активность ГДК увеличивается в полушариях головного мозга крыс в первый "стрессовый" период на 24 % и незначительно снижается в агональном периоде (на 16 %).

Предварительная инъекция крысам L-глутамата существенно увеличивает "максимальную" активность ГДК в первый "стрессовый" период на 12 % и в агональный период на 36 %. Инъекция L-аланина также повышает "максимальную" активность ГДК в полушариях головного мозга крыс в агональный период при ГЗП.

Таким образом, можно предположить, что введение L-аланина, незначительно увеличивая активность ГДК, приводит к повышению уровня тормозного нейромедиатора — ГАМК в головном мозге при ГЗП. Усиление этой реакции инъекциями L-глутамата и L-аланина свидетельствует о защитном действии этих аминокислот. При этом ГАМК защищает нейроны не только как тормозной нейромедиатор, но и как дополнительный источник энергии при функционировании цикла Робертса в митохондриях и синаптосомах головного мозга. Эти данные и составили основной вклад в разработку вопроса о существенности увеличения средней продолжительности жизни (СПЖ) при острой ГЗП у крыс под влиянием предварительных инъекций аминокислот.

Обобщенные результаты исследований представлены в табл. 3. При постановке экспериментов мы учитывали продолжительность жизни при ГЗП каждой крысы с точностью до 1 минуты. Практически это достигалось наблюдениями не только времени наступления бокового положения и судорог, а также времени "последнего агонального вдоха", через 15–30 с после которого животное извлекали из гермокамеры.

Как видно из табл. 3, при остром воздействии факторов замкнутого пространства наблюдается СПЖ у большей части крыс от 33 до 40 мин после помещения их в гермокамеру (84 % животных). У части животных (16 %) при этом СПЖ достигает 41–44 минуты. Такое бимодальное распределение обусловлено различной чувствительностью крыс к гипоксии. При предварительном введении аминокислот продолжительность жизни крыс при ГЗП увеличивается и бимодальное распределение времени агонального состояния не наблюдается. Так, при предварительном введении l-аланина в дозе 2,0 ммоля/кг время наступления клинической смерти крыс при ГЗП увеличивается, средняя продолжительность жизни колеблется в пределах 35–46 минут.

Предварительное подкожное введение L-глутамата (2,0 ммоль/кг) еще больше увеличивает продолжительность жизни крыс при ГЗП; средняя подолжительность жизни при этом колеблется от 39 до 48 минут.

Учитывая вышеизложенное, можно считать целесообразным применение L-аланина или L-глутамата для защиты от действия факторов замкнутого пространства. Защитное действие инъекций L-аланина и L-глутамата при ГЗП, по-видимому, обусловлено многими механизмами. В частности, большая эффективность применения L-глутамата может быть обусловлена и его непосредственными нейротрансмиттерными функциями в нейроструктурах головного мозга и, что более вероятно, действием продуктов его метаболизма, таких как ГАМК и N-ацетил-L-глутамат. Однако общим механизмом защитного действия L-аланина и L-глутамата при ГЗП является их использование в энергетических процессах митохондрий головного мозга, главным образом путем окислитель-ного декарбоксилирования образующихся из них пирувата и a-кетоглутарата.

В заключение следует отметить множественность механизмов защитного действия исследованных нами аминокислот при ГЗП, в частности, возможность активации эндокринной системы как реакции на стресс. Кроме того, существуют и общие механизмы, объясняющие наблюдаемое нами снижение окислительного катаболизма L-аланина и L-глутамата в агональной стадии гипоксии замкнутого пространства, в частности, накопление в клетках мозга в этот период НАДН₂ и, возможно, ацилов КоА.

Литература
1. Волков М.С., Генкин А.М., Глотов Н.А., Маевский Е.И. Глутаминовая кисло-та. Биохимическое обоснование практического использования. —Свердловск: Средне-Уральское книжное изд-во, 1975. —119 с.
2. Хухо Ф. Нейрохимия. —М.: "Мир", 1990. —383 с.
3. Al-Swayeh O.A., Moore R.K. Aminoacids dilate resistance blood vessels of the perfused rat mesentery // J. Pharm. and Pharmacol. —1989. —41, N 10. —P. 723–726.
4. Samuels S., Fish I., Schwartz S.A. Anticonvulsant activity of glycylglycine and d-aminovaleric acid: evidence for glutamine exchange in aminoacid transport // J. Neurochem. —1983. —40, N 4. —P. 1063–1068.
5. Кресюн В.И. Активность Mg⁺⁺-АТФ-азы фракций митохондрий мозга при хроническом стрессе и его коррекция психотропными средствами // Укр. био-хим. журн. —1984. —56, N 6. —С. 637–641.
6. Максимович Я.Б., Гайденко А.И. Прописывание, несовместимость и побочное действие лекарственных средств // 4-е изд., перераб. и доп. —К.: Здоровье, 1988. —144 с.
7. Dolp R., Ahnefeld F.W., Grunert A., Shmitz E. Clinical studies on free amino acid concentration in plasma. Development of an acid pattern for parenteral nutrition during stress metabolism // Acta chir. scand. —1979. —145, N 494. —P. 127–129.
8. Абу Асали И.И., Розанов В.А., Розанов А.Я. Изучение защитного действия аминокислот — субстратов окисления, витаминов, коферментов и их комплексов при гипоксии замкнутого пространства // Физиологический журнал. —1990. —36, N 4. —С. 32–37.
9. Переверзев В.А., Кубарко А.И., Переверзева Е.В., Котов Ю.А., Бережко Т.А. Влияние совместного применения серотонина и гистамина на устойчивость крыс и мышей к различным видам гипоксии // Весці АН Беларусі, сер. хім. н. —1997. —N 2. —С. 98–102.
10. Шейхова Р.Г., Пашаева Д.Э., Эмирбекова А.А., Эмирбеков Э.З. N-ацетилированные дикарбоновые аминокислоты в мозге при гипотермии // Пробл. криобиол. —1996. —N 4. —С. 38–41.
11. Pellegrini-Gianpietro D.E., Cherici G., Alesiani M., Carlo V., Moroni F. Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia-induced neuronal damage // J. Neurosci. —1990. —10, N 3. —P. 1035–1041.
12. Дорощук В.П. Патогенетическое лечение угрожающих нарушений дыхания. К.: Здоров'я, 1979. —246 с.
13. Розанов А.Я., Трещинский А.И., Хмелевский Ю.В. Ферментативные про-цессы и их коррекция при экстремальных состояниях. К.: Здоров'я, 1985. —208 с.
14. Храпак В.В. Механізми токсичних гіпоксій та роль антидотів у їх профілактиці і лікуванні // Современные проблемы токсикологии. —1988. —N 3. —С. 30–38.
15. Акбарі Р., Сарр С., Петросян А.Л. Порівняльне дослідження окислювального декарбоксилювання 1-¹⁴С-2-оксокислот у відділах головного мозку щурів // Вестник Одеського держ. університету. —1999. —Т. 4. —вип. 3. —С. 5–9.
16. Сытинский И.А., Бернштамм В.А., Прияткина Т.М. Активность глутаматдекарбоксилазы и содержание гамма-аминомасляной кислоты в различных отделах головного мозга // Нервная система. —1965. —N 6. —С. 19–26.
17. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистиче-ской обработки и планирование. —Л.: Изд. Ленинградского университета, 1971. —80 с.
18. Рокитский П.Ф. Биологическая статистика. —Минск: "Вышэйшая школа", 1973. —320 с.