УДК 615.9:615.015

МЕХАНИЗМЫ ПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ОЛОВОСОДЕРЖАЩИХ КОМПЛЕКСОВ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОРФИРИНОВ ПРИ ТОКСИЧЕСКИХ ГИПЕРБИЛИРУБИНЕМИЯХ

Т.О. Филиппова, д.б.н., Б.Н. Галкин, д.б.н., Н.Я. Головенко, акад. АМН Украины, З.И. Жилина, д.х.н., С.В. Водзинский, к.х.н.

Государственный университет им. И.И. Мечникова, Одесса

Ранее G.S. Drummond и A. Kappas обнаружили [1-3], что оловянные комплексы аналогов природных порфиринов (Sn⁴⁺-протопорфирин и Sn⁴⁺-мeзoпopфиpин) являются индукторами цитохрома Р-450 и зависимых от него монооксигеназ. Изучение этих комплексов показало, что в основе индуцирующего эффекта лежит способность ингибировать активность гемоксигеназы (ЕС 1.14.99.3) — фермента, ответственного за деградацию гема и, следовательно, за образование билирубина в организме. Другие соединения олова, как органические, так и неорганические, такими свойствами не обладают. На основании этих данных было предложено использовать Sn⁴⁺-пpoтопopфиpин IX и Sn⁴⁺-мeзопopфиpин для снижения уровня билирубина при гемолитических анемиях у новорожденных. Эффективность соединений показана в эксперименте и клинике [4, 5].

Известно, что билирубин токсичен для нервной и иммунной систем организма. Гипербилирубинемия сопровождает многие патологические состояния: инфекционные и неинфекционные гепатиты, аутоиммунные заболевания. Особое место среди них занимают случаи, связанные с поступлением в организм чужеродных соединений (ксенобиотиков). Это могут быть как лекарственные препараты [6], так и токсические продукты и отходы промышленного производства, поступающие в окружающую среду [7, 8]. Не исключено, что неблагоприятная экологическая обстановка в ряде районов Алтайского края способствовала увеличению частоты рождения "оранжевых детей" с гипербилирубинемией окончательно не установленного происхождения. Свой вклад может вносить и низкодозовое облучение населения, обусловленное близостью Семипалатинского полигона. Поэтому не исключено появление данной проблемы и в других неблагополучных регионах, в частности, в зонах, пострадавших от Чернобыльской аварии.

В связи с этим, целью настоящего исследования было изучение эффективности оловянных комплексов мезо-замещенных синтетических порфиринов при токсических гипербилирубинемиях и выяснение некоторых механизмов их действия. В работе использовали комплексы с оловом мезо-тетрафенилпорфирина (Sn⁴⁺-TФП) и тетратозильной соли мезо-тетракис(N-метил-3-пиридил)порфирина (Sn⁴⁺-ТПП). Они выбраны с учетом возможности дальнейшей химической модификации и того факта, что мезо-замещенные порфирины не метаболизируются гемоксигеназой.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили на мышах-самцах F₁(CBA·C₅7B1), тетрагибридах CBWA и нелинейных с массой тела 8—23 г, полученных из питомника "Столбовая".

Оловянные комплексы мезо-замещенных порфиринов и протопорфирина IX синтезировали по методам [9, 10].

Токсические гипербилирубинемии индуцировали введением солянокислого фенилгидразина (60 мг/кг, подкожно, дважды через 48 ч); гемина (100 мг/кг, подкожно, однократно, за 24 ч до опыта) или тетрахлорметана (20 мкМ/кг, перорально, однократно, за 24 ч до опыта).

Аутоиммунную гемолитическую анемию (АГА) вызывали у мышей еженедельным введением внутрибрюшинно 2·10⁸ отмытых от белков плазмы эритроцитов крысы [11].

Уровень сывороточного билирубина определяли флуориметрически по методу [12]; активность гемоксигеназы — по скорости накопления билирубина [13|. Содержание цитохрома Р-450 определяли по СО-пику восстановленного гемопротеида [14]. Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по накоплению малонового диальдегида (МДА) в инкубационной среде [15]. Содержание белка определяли по Лоури |16].

Результаты и их обсуждение

Способность оловянных комплексов мезо-замещенных порфиринов снижать уровень билирубина изучена на трех моделях токсических гипербилирубинемий. Их вызывали с помощью гемолитического агента — фенилгидразина, индуктора гемоксигеназы — гемина и гепатотропного яда — тетрахлорметана. Исследуемые комплексы вводили подкожно в дозе 100 мкМ/кг, либо предварительно, за 1 сут до токсиканта, либо после его воздействия, в момент наивысшего подъема уровня билирубина в сыворотке. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что sn⁴⁺-tФП и sn⁴⁺-ТПП уменьшают интенсивность гипербилирубинемий различного происхождения. Причём, в случае ССl₄ они полностью предупреждают подъем уровня билирубина в сыворотке. Обращает на себя внимание одинаковая эффективность обоих комплексов: водорастворимого sn⁴⁺-ТПП и водонерастворимого sn⁴⁺-tФП, несмотря на то, что последний в течение длительного периода после инъекции в виде суспензии в твине сохраняется в месте введения.

Аналогичная картина наблюдается и в том случае, когда оловянные комплексы вводили животным на фоне сформировавшейся гипербилирубинемии. Следовательно, изученные соединения эффективны как при профилактическом, так и при лечебном применении.

Следствием поступления в организм многих токсических и лекарственных средств является развитие аутоиммунных процессов. Существенное место среди них занимают гемолитические анемии. В связи с этим было изучено влияние Sn⁴⁺-TФП на течение индуцированной у мышей аутоиммунной гемолитической анемии. О тяжести процесса судили по уровню ретикулоцитов в крови, количество которых определяли еженедельно. Одновременно контролировали содержание билирубина в сыворотке. Sn⁴⁺-TФП вводили в дозе 100 мкМ/кг, подкожно, однократно, одновременно с первой иммунизацией. Результаты этого исследования представлены в табл. 2 и на рисунке. Наблюдение в течение 6 нед показало, что оловянный комплекс не оказывает влияния на динамику развития процесса. У животных обеих групп на 4-ой нед отмечен пик числа ретикулоцитов, а на 5-ой — самый высокий уровень билирубина. Однако, у мышей, получивших sn⁴⁺-tФП, во все сроки исследования количество ретикулоцитов и содержание билирубина было в 1,5—2 раза меньше, чем у нелеченых. Следовательно, оловянный комплекс не только снижает уровень билирубина, но и облегчает течение аутоиммунного процесса. Последнее может быть объяснено также супрессивным воздействием синтетических порфиринов и их металло-комплексов на гуморальный иммунный ответ [17].

Известно, что в основе действия оловянного комплекса протопорфирина IX лежит способность к конкурентному ингибированию гемоксигеназы, ответственной за образование билирубина [I., Поэтому были изучены влияние мезо-замещенных синтетических аналогов на активность этого фермента, а также интенсивность перекисного окисления липидов и содержание цитохрома Р-450. Ранее нами было показано [18], что при внутрибрюшинном введении Sn⁴⁺-TФП индуцирует цитохром Р-450, активирует зависимые от него монооксигеназы и ингибирует гемоксигеназу и ПОЛ в печени крыс. Учитывая, что способность снижать уровень билирубина при гипербилирубинемиях различного происхождения выявлена при подкожном введении мезо-замещенных порфиринов, представлялось целесообразным сопоставить воздействие оловянных комплексов на микросомальные системы при различных путях их поступления в организм. Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что независимо от способа введения (внутрибрюшинного или подкожного) sn⁴⁺-tФП вызывает однотипные изменения: индуцирует цитохром Р-450, подавляет активность гемоксигеназы и интенсивность ПОЛ в печени. Различия отмечены лишь в отношении гемоксигеназы селезенки, активность которой при подкожном введении комплекса не изменялась. Эксперименты in vitro показали (табл. 4), что активность гемоксигеназы печени и селезенки подавляется в присутствии sn4+-протопорфирина ix и sn⁴⁺-tПП и не изменяется при добавлении в инкубационную среду sn⁴⁺-tФП. Оловянный комплекс протопорфирина ix оказывает более выраженное ингибирующее действие по сравнению с мезо-замещенным аналогом: в первом случае активность гемоксигеназы селезенки снижается в 5 раз, печени — в 3 раза, а во втором случае — в 2 и 1,5 раза, соответственно. Эффективность sn⁴⁺-tФП in vivo может, по-видимому, объясняться появлением в организме его метаболитов, способных взаимодействовать с ферментом. Ни один из изученных оловянных комплексов не влиял in vitro на интенсивность ПОЛ в мембранах микросом печени. Подавление активности этой системы in vivo имеет, по-видимому, опосредованный характер. Известно, что индукция цитохрома Р-450 сопровождается снижением интенсивности ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума [19]. Проведенное исследование позволяет заключить, что оловянные комплексы синтетических мезо-замещенных порфиринов эффективно снижают уровень билирубина при различных гипербилирубинемиях: как токсических, так и аутоиммунных. Sn⁴⁺-TФП может быть использован для создания препарата длительного действия для коррекции патологических состояний, имеющих хронический характер. Токсичность тетрахлорметана и других хлорорганических соединений связана, в основном, с деструкцией мембран. Поэтому представляется целесообразным включение оловянных комплексов в фосфолипидные липосомы. Такая лекарственная форма может быть полезной и при гемолитической болезни новорожденных. Липосомы, введенные внутривенно, интенсивно поглощаются макрофагами печени и селезенки, с которыми, в основном, и связана гемоксигеназная активность этих органов. Кроме того, в последнее время показано, что гемолиз эритроцитов при АВО-несовместимости матери и плода является не комплементзависимым, а осуществляется макрофагами селезенки [20].

ЛИТЕРАТУРА
1. Drummond G.S., Kappas A. Prevention of Neonatal Hyperbilirubinemia by Tin-protoporphyrin IX a Potent Competitive Inhibitor of Heme Oxidation // Proc. Natl. Acad. Sci USA. —1981. —V. 78, N 10. —P. 6466—6470.
2. Drummond G.S., Kappas A. Chemoprevention of Neonatal Jaundice: Potency of Tin-protoporphyrin in an Animal Model // Science. —1982. —V. 217. N 4566. —Р. 1250—1252.
3. Simionatto C.S., Anderson K.E,, Drummond G.S., Kappas A. at al. Studies on the Mechanisms of Sn-protoporphyrin Suppression of Hyperbilirubinemia. Ingibition of Geme Oxidation and Bilirubin Production // J. Clin. Invest. —1985. —V. 75. N 2. —P. 513—521.
4. Drummond G.S., Kappas A. An Experimental Model of Postnatal Jaundice in the Suckling Rat. Suppression of induced Hyperbilirubinemia by Sn-protoporphyrin // J. Clin. Invest. —1984. —V. 74. N 7. —P. 142—149.
5. Kappas A., Drummond G.S., Manola Th., Petmezaki S., Valaes T. at al. Sn-Protoporphyrin Use in the Management of Hyperbilirubinemia in Term Newborns with Direct Coombs-Positive ABO-Incompatibility // Pediatrics. —1988. —V. 81. N 4. —Р. 485—497.
6. Sanford-Driscoll М., Knodel L.С. Induction Drug //Exp. and Clin. Pharm. —1986. —V. 20. P. 925.
7. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. —Киев: Здоровье, —1989. —168 с.
8. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. —Москва: Медицина, 1986. —280 с.
9. Rothemund P., Menotti A.R. Porphyrin Synthesis. V. The Metal Complex Salts of a,b,g,d-Tetraphenylporphine // J. Amer. Chem. Soc. —1948. —V. 70. N 5. —P. 1808—1812.
10. Жилина 3.И., Водзинский С.В., Андронати С.А. Синтез и спектральные характеристики порфиринов с гетерильными и бициклическими мезо-заместителями // Укр. хим. журнал. —1990. —Т. 56. N 10. —С. 1084—1087.
11. Максимов А.В. Экспериментальное изучение аутоиммунной гемолитической анемии и влияние иммуномодуляторов на ее индукцию и течение // Иммунология. —1983. —N 3. —С. 53—57.
12. Roth M. Dosage fluorimetrique de la bilirubin // Clin. Chem. Acta, —1967. —N 17. —P. 487—492.
13. Tenhunen R., Marver H.R., Schmid R. Microsomal Heme Oxygenase: Characterisation of the Enzyme // J. Biol. Chem. —1969. —V. 244. N 23. —P. 6388—6396.
14. Omura Т., Sato R. The Carbon Monooxide Binding Pigment of Liver Microsomes // J. Biol. Chem. —1964. —V. 239. N 7. —P. 2379—2385.
15. Современные методы в биохимии /Под ред. Ореховича В.Н. —Москва: Медицина, 1977. —С. 62-67.
16. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Prothein Measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. —1951. —V. 193. N 1. —P. 265—275.
17. Головенко H.Я., Филиппова Т.О., Василенко Л.С., Жилина 3.И., Водзинский С.В. Иммунотропные свойства синтетических порфиринов // Физиологически активные вещества. —1990. —N 22. —С. 9—13.
18. Головенко H.Я., Галкин Б.H., Филиппова Т.О., Жилина 3.И., Тиунов Л.А., Олешко Т.И., Водзинский С.В. Индукция тетрафенилпорфирином-Sn⁴⁺ цитохрома Р-450 // Бюл. эксперим. биол. и мед. —1989. —N 3. —С. 291—294.
19. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. —Москва: Наука, 1975. —327 с.
20. Carreras V.L.A., Castro R.A. Complement is not activated in ABO-hemolytic disease of the newbom // Fox. Sang. —1990. —V. 58. N 3. —Р. 231.