УДК 613.63:62.017.11

ОЦІНКА ЗНАЧУЩОСТІ ЗСУВІВ В ІМУННІЙ СИСТЕМІ ПРИ ДІЇ ТОКСИКАНТІВ БІОХІМЗАВОДУ

Сердюк А.М., член-кор. АМН України, Винарська О.І., к.м.н.

Український науковий гігієнічний центр МОЗ України, Київ

З токсикологічних позицій до цього часу залишаються невирішеними багато актуальних питань, пов'язаних із оцінкою ролі для організму порушень в імунній системі за дії різних за походженням чинників довкілля. Недостатньо зрозуміло, які реакції є компенсаторними, спрямованими на підтримку гомеостазу, а які свідчать про ушкодження механізмів імунного захисту. І, нарешті, головне невирішене питання: що є науково-методичною основою токсиколого-гігієнічного вивчення факторів середовища, які змінюють імунологічну реактивність організму?

Досягнення імунології в останні роки дозволяють з нових позицій підійти до розгляду значущості для організму змін в імунній системі, викликаних антропогенними забрудненнями.

За даними літератури, при токсикологічній оцінці хімічних факторів навколишнього середовища широко застосовується двохетапне дослідження їх імунотоксичного потенціалу [1]. Для оцінки дії імунотоксикантів в експерименті деякі автори обирають 2-3 моделі імунорезистентності [2]. За думкою J.H. Exon [3], при виборі тестів для імунотоксикологічного дослідження слід встановити декілька критеріїв. Головними з них є здатність протистояти дії інфекційних агентів і розвитку неопластичних процесів.

На основі порівняння чутливості різних методів і тестів двохетапної системи визначення імунотоксичності ряд авторів [4] вважає можливим скоротити обсяг досліджень, зупинившись на кількісних характеристиках субпопуляцій Т-лімфоцитів і параметрах Т-залежної антитілопродуції. До цих двох тестів рекомендується додати третій — реакцію гіперчутливості сповільненого типу або визначення маси тимусу.

В імунотоксикологічних дослідженнях особливу увагу, на думку ряду авторів [5], необхідно приділяти функції макрофагів і природних кілерних клітин, оскільки вони відіграють важливу роль у забезпеченні імунорезистентності.

У теперішній час відсутні визнані критерії, які характеризують хімічний агент як імунотоксин для гризунів, хоча більшість дослідників вважають, що найкращими є такі, котрі враховують імунні порушення, що призводять до небажаних ефектів, зокрема, до інфекційних захворювань.

В межах дослідження M.I. Luster та співавт. [4] був використаний слідуючий основний принцип: дія хімічного агенту викликає дозозалежності ефект (p < 0,05) хоча б в одному із тестів, а також різко змінює результати двох або більше тестів на рівні найвищих доз визначуваної речовини (p < 0,05). Цей підхід розглядається як досить вільне тлумачення імунотоксичності, однак він прийнятний для порівняльного аналізу окремих імунологічних тестів.

Раніше нами був запропонований метод визначення значущості порушень імунних реакцій організму при дії факторів навколишнього середовища. Суть його полягала у тому, що у тварин визначали рівень специфічних антитіл або аутоантитіл, вводили сироватку крові, яка їх містить, інтактним самкам на 10-й день вагітності і враховували ембріональний розвиток плоду. Диференціацію захисних та патологічних реакцій здійснювали на основі реєстрації постімплантаційної загибелі плоду [6]. Однак, незважаючи на високу інформативність даного метода, в якості недоліку можна відзначити його велику трудоємність і неекономічність.

Продовжуючи дослідження у цьому напрямку ми використовували навантаження мікробами-продуцентами на фоні змін імунологічної реактивності або комбіноване антигенне навантаження — імунізація тварин еритроцитами барану (Т-залежний антиген) і прогрітою вакциною (Т-незалежний антиген).

Метою роботи було вивчення значущості для організму зсувів в імунній системі при дії токсикантів біохімзаводу.

Матеріали та методи дослідження

Експериментальні дослідження з вивчення впливу основних викидів Трипільського біохімзаводу на імунологічну реактивність організму здійснені на 40 морських свинках. Тварини були розподілені на 4 групи по 10 в кожній: 1 група — інтактний контроль, тварин 2, 3 та 4 груп інтратрахеально затруювали відповідно газо-повітряними викидами цехів ферментації, сушки і складання білково-вітамінного концентрату.

Дослідження з вивчення впливу концентрату кормового лізину (ККЛ) на імунологічну реактивність організму здійснені на 50 білих щурах. Тварини були розподілені на 5 груп по 10 у кожній: 1 групу затруювали ККЛ у концентрації, яка у 7 разів нижча від ОБУВ (0,1 мг/м³); 2 групу — у концентрації, яка відповідає ОБУВ лізину в атмосферному повітрі (0,7 мг/м³); 3 групу — у концентрації, яка відповідає ГДК лізину в повітрі робочої зони (5,0 мг/м³); 4 групу — у концентрації 5 ГДК (25 мг/м³); 5 група — контроль.

Вивчення впливу навантаження мікробами-продуцентами на реактивність лабораторних тварин включало постановку керато-кон'юнктивальної проби (ККП) Шереня у морських свинок [7], котрі підлягали дії викидів біохімзаводу з виготовлення концентрату кормового лізину, і групи контрольних тварин. ККП полягала у нанесенні на кон'юнктиву ока двох крапель 1 млрд. мікробної завісі тест-мікробів, встановленої за оптичним стандартом мутності. Контрольній групі тварин на кон'юнктиву ока наносили 2 краплі стерільного фізіологічного розчину. У подальшому протягом 2-х тижнів здійснювали спостереження за станом тварин.

Для виготовлення вакцини методом прогрівання при 68-70 °С використана добова культура Staphylococcus aureus N 209, отримана з музею живих культур НДІ ЕІХ ім. Л.В. Громашевського. Під ефірним наркозом кожному щуру вводили окремо підшкірно по 0,7 мл на 100 г маси тіла тварини 25 % завісі еритроцитів барана і вакцини у робочому розведенні (1 млрд мікробних тіл в 1 мл). На 21-у добу після імунізації здійснювали постановку імуно-алергологічних тестів.

Результати та їх обговорення

Проведені дослідження свідчать, що газо-повітряні викиди цехів ферментації (2 група), сушки (3 група) і складання білково-вітамінного концентрату (4 група) спричиняють імуномодулюючу та сенсибілізуючу дію, що проявлялося у зміні вмісту і функціонального стану Т- і В-лімфоцитів, збільшенні відсотку дегрануляції базофільних гранулоцитів, анафілактичній реакції.

Так, було встановлено зниження відсотку Е-розеткоутворюючих клітин в 2, 3 і 4 (дослідних) групах порівняно з 1 (контрольною) (відповідно, 25,3±1,3; 23,4±3,1; 26,9±1,7 і 34,2±2,4%, p < 0,05). Така ж закономірність була встановлена і відносно вмісту ЕАС-розеткоутворюючих клітин, який становив, відповідно, 9,1±0,5; 9,0±1,0; 9,6±0,8 та 14,6±1,5 %, p < 0,05.

Найвиразнішу дегрануляцію базофілів — 40,0 % у присутності антигену викликали сироватки тварин 2-ї групи, сироватки тварин 3-ї групи — 21,4 % і 4-ї — 19,2 %, тоді як контрольні — 5,5 % (від 10 до 20 % реакція вважається слабкопозитивною, від 20 до 30 % — позитивною, > 30 % — різкопозитивною).

Анафілактична реакція спостерігалася у тварин усіх дослідних груп. Так, у 5 тварин другої групи і 5 — третьої групи відмічалося багатократне почісування мордочки та чхання, що оцінюється в 1 бал. Крім того, у 3-х морських свинок третьої і 4 четвертої груп відзначалися кашель і мимовільне сечовипускання, що оцінюється у 2 бали. Анафілактичні індекси у тварин цих 3-х груп дорівнювали, відповідно, 0,6; 1,4 та 1,0. В контрольній групі анафілактична реакція була відсутня.

На І етапі були досліджені культуральні, морфологічні та біохімічні властивості двох штамів мікробів-продуцентів лізину: Brevobacterium sp., отриманого з музею Всесоюзного колекційного центру промислових мікроорганізмів ВНДІ генетики, і Brevobacterium flavum — з мікробіологічної лабораторії Трипільського біохімзаводу.

На ІІ етапі досліджень була здійснена проба на чутливість до інфекції, яка дозволяє судити про зміну резистентності організму під впливом вивченого фактора. Результати ККП у морських свинок при бактеріальному навантаженні показали, що прояв змін із боку ока або загибель тварин залежали як від характеру навантаження, так і вихідного стану імунологічної реактивності організму (див. таблицю). Так, у тварин, які не підлягали сенсибілізуючій дії викидів Трипільського біохімзаводу, нанесення на кон'юнктиву ока мікробної завісі як музейного, так і лабораторного штаму бревобактерій не викликало ні загибелі тварин, ні змін кон'юнктиви ока. У тварин, попередньо сенсибілізованих викидами цеху ферментації, спостерігали утворення гнійних виділень в оці, помутніння рогівки, розлад із боку шлунково-кишкового тракту.

Слід зазначити, що лабораторний штам бревобактерій частіше викликав позитивну ККП порівняно з музейним. Цю обставину необхідно враховувати при оцінці розсіювання виробничих штамів-продуцентів у навколишньому середовищі і можливості їх шкідливого впливу на організм людини.

У тварин, яких затруювали ККЛ у дозі 0,1 мг/м³ (1 група), було встановлено пригнічення Т-клітинної ланки імунітету, що проявлялося в достовірному зменшенні кількості Т-лімфоцитів (21,6±1,3 %) порівняно з контролем (34,4±1,1 %).

Вплив лізину у дозі 0,7 мг/м³, також викликав зниження рівня Т-клітинної популяції в периферичній крові (20,0±0,8 % — в досліді, 34,4±1,1 % — в контролі, p< 0,05). У 14,3 % тварин розвивався лейкоцитоз і лімфопенія.

При інтратрахеальному затруюванні ККЛ простежується залежність виразності ефекту від дози. Так, у тварин 3-ї групи, крім зниження кількості Т-лімфоцитів (17,3±1,7 %, в контрольній групі — 34,4±1,1 %, p< 0,05), спостерігалося пригнічення ЕАС-розеткоутвоюючої здатності лімфоцитів (19,1±1,5 %, у контролі 25,0±1,2 %, p< 0,05), посилення дегрануляції базофільних гранулоцитів у присутності як тканьового антигену, так і гаптену (відповідно, у досліді 13,1 та 10,9 %, в контролі 5,3 та 4,0 %).

Збільшення дози ККЛ у 5 разів (4 група) викликало активацію неспецифічних факторів захисту організму, про що свідчать збільшення фагоцитарної активності нейтрофілів, а також підвищення рівня лейкоцитів у частини тварин (28,6 %). Поряд з цим були змінені показники клітинного імунітету. Як і у попередніх групах, було встановлено зниження відносної кількості Е-РУК (19,7±1,9 %, у контролі 34,4±1,1 %, p< 0,05). Сироватки тварин, яких затруювали ККЛ у концентрації 25 мг/м³, посилювали дегрануляцію базофілів як з тканьовим антигеном, так і з гаптеном (відповідно, у досліді 20,0 та 17,1 %, у контролі 5,3 та 4,0 %). Виявлені імунотоксичні ефекти мали транзиторний характер.

Для визначення значущості виявлених зсувів і повноти їх відновлення у період післядії було використано комбіноване антигенне навантаження. На 21-у добу після імунізації було зареєстровано достовірне збільшення відносної кількості лімфоцитів у тварин усіх дослідних груп. Так, у тварин 1-ї групи цей показник становив 70,4±2,1 %, 2-ї групи — 67,0±2,3 %, 3-ї групи — 68,1±3,8 %, 4-ї — 65,3±2,4 %, тоді як у контролі — 55,1±1,9 %. У щурів 3-ї групи відмічалася також нейтропенія (24,1±2,1 %, у контролі — 38,3±4,3 %, p < 0,05), однак це не відбивалося на функціональній активності нейтрофілів — відсоток активно фагоцитуючих клітин залишався на досить високому рівні (87,1±2,6 %, у контролі — 90,1±1,4 %, p > 0,05).

Таким чином, проведені дослідження свідчать про те, що інтратрахеальне затруювання ККЛ у різних дозах спричиняло імуносупресорну дію на Т-систему імунітету та сприяло формуванню слабко вираженої гіперчутливості негайного типу (у дозах 5,0 та 25,0 мг/м³). Виявлені порушення мали транзиторний характер. Застосування методу комбінованого антигенного навантаження дозволило встановити зміни кількісних характеристик відносних величин лімфоцитів в усіх групах, а в 3-й групі — і нейтрофільних гранулоцитів, що можна трактувати як адаптаційну реакцію організму на екзогенну дію.

Отже аналіз власних експериментальних досліджень показав, що оцінка значущості імунологічних ефектів за умов дії факторів довкілля визначається реакцією імунної системи на додаткове навантаження, яка дозволяє виявити її компенсаторно-пристосовчі можливості. Отримані результати свідчать про імуномодулюючу та сенсибілізуючу дію всіх вивчених газо-повітряних викидів біохімзаводу. Однак, застосування в якості тест-навантаження мікробів-продуцентів (бревобактерій) дозволило виявити зниження резистентності організму тільки у тварин, сенсибілізованих газо-повітряними викидами цеха ферментації. Це в свою чергу говорить про те, що використання в якості навантаження інфекційних агентів із подальшою оцінкою особливостей перебігу патологічного процесу є більш адекватним та економічним способом диференціації захисних і патологічних реакцій імунної системи організму за умов дії факторів навколишнього середовища, ніж комбіноване антигенне навантаження.

ЛІТЕРАТУРА
1. M.I.Luster, A.E.Munson, P.T.Thomas et al. Methods evaluation: development of a testing battery to assess chemical induced immunotoxicity: National toxicology programs guidelines for immunotoxicity evaluation in mice / // J. Fund. Appl. Toxicol. —1988. —Vol. 10, N 1. —P. 2—19.
2. Vos J.G., Van Louren H. Immunotoxicity testing in the rat // Environmental chemical exposures and immune system Integrity / Adv. Modern Environ. Toxicol. —1987. —Vol. 13. —P. 167—178.
3. Exon J. H. Concepts and difinitions in immunotoxicology // Immunotoxicity of Metals and Immunotoxicology / Ed. by A. D. Dayan et al. —NY, London: Plenum Press, 1990. —P. 29—36.
4. M. I. Luster, A. Portier, D. G. Pait et al. Risk assessment in immunotoxicology. 1. Sensitivity and predictability of immune tests // J. Fund. Appl. Toxicol. —1992. —Vol. 18, N 2. —P. 200—210.
5. F. Spreafico, A. Recchi, M. Sironi et al. Immune cells and their modulation by exogenous substances // Immunotoxicology. A. Current Perspective of Principles and Practice: NATO ASI Series. / Ed. by P. W. Mullen. —1984. —P. 15—28.
6. Виноградов Г. И. , Винарская Е. И. Гигиеническая оценка сенсибилизирующего действия химических факторов окружающей среды // Методология фундаментальных исследований в гигиене окружающей среды: Сб. науч. тр. НИИ ОКГ им. А. Н. Сысина. —Москва, 1989. —С. 20—27.
7. Л. В. Григорьева, Л. Ф. Ерусалимская, Г. И. Виноградов и др. Проявление инвазивных свойств патогенных эшерихий при заражении ими экспериментальных животных с различным иммунным статусом // Микробиол. журн. —1989. —N 1. —С. 92—95.