|
МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК: 577. 152. 6 ВЛИЯНИЕ ДДТ НА АКТИВНОСТЬ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА В ПЕЧЕНИ, ЛЕГКИХ И ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС В.В. Сумбаев, к.б.н., И.М. Ясинская Одесский государственный университет им. И.И. Мечникова, Одесса Синтаза оксида азота (NOS — nitric oxide synthase, КФ 1.14.13.19) катализирует образование NO и цитруллина из аргинина и О2 через N-оксиаргинин [1]. В качестве донора электронов фермент использует NADH+H+. NOS в организме животных представлена тремя изоформами — индуцибельной (iNOS) и двумя конститутивными — эндотелиальной (eNOS) и нейрональной (nNOS). Все три изоформы состоят из гомолимеров, включающих редуктазный, оксигеназный и кальмодулинсвязывающий домены, обладают сходным механизмом действия, но различаются молекулярной массой. Для проявления каталитической активности NOS требуются кофакторы — кальмодулин, Са2+, (6R)-5,6,7,8-тетрагидро-L-биоптерин, ФАД и ФМН. Функцию каталитического центра выполняет тиолсвязанный гем [1]. Установлено, что ДДТ, являющийся индуктором цитохрома Р-450 (изоформ 1А1, 1А2 и 1В1) [2], аллостерически ингибирует ксантиноксидазу, тормозя при этом образование ею супероксидного радикала [3]. Известно, что супероксид и NO, а также пероксинитрит (ОNOО-) — продукт их конденсации — ингибируют каталитическую активность всех представителей суперсемейства цитохрома Р-450 [4]. В последние годы было установлено, что стероиды ингибируют экспрессию генов NOS [5]. ДДТ по структуре родствен многим стероидам, в частности эстрогенам и некоторым глюкокортикоидам [5, 6]. В связи с этим, возможно, что ДДТ влияет на экспрессию генов NOS, а кроме того теоретически может являться ее ингибитором, как гемопротеида, так как именно Fe2+ в составе гемопротеидов (в основном цитохромов Р-450) связывается с ДДТ и гидроксилирует его до 1,1-дихлордифенилоксиацетата [7]. Целью настоящей работы явилось изучение влияния ДДТ на активность синтазы оксида азота в печени, легких и головном мозге крыс в опытах in vivo и in vitro. Материалы и методы исследования Влияние ДДТ на активность NOS in vivo изучали на 10 однопометных самках крыс линии Вистар массой тела 100±20 г в возрасте 3-х месяцев. Крыс разделяли на две группы (по 5 животных), первой из которых (контрольная) ежедневно в течение 3-х дней с интервалом в 24 ч внутрибрюшинно вводили по 0,2 мл персикового масла, а второй (опытная) — раствор ДДТ (10 мг/мл) в персиковом масле из расчета 20 мг/кг массы тела по той же схеме. Через 120 мин после последней инъекции крыс декапитировали и определяли активность NOS, ксантиноксидазы и содержание цитохрома Р-450 в печени, легких и головном мозге. Активность NOS определяли в реакционной системе, содержащей 2,5 мл 0,1 М трис-НСl буфера, рН 7,4, в состав которого входил также СаСl2 (10 мМ), 0,3 мл водного раствора аргинина (субстрат NOS) в концентрациях 40, 80, 160 и 320 мкМ [9] (конечные концентрации аргинина составили соответственно 4, 8, 16 и 32 мкМ) и 0,1 мл 1 мМ водного раствора NADPH+H+. Реакцию запускали внесением 0,1 мл гомогенатов печени, легких и головного мозга (гомогенаты готовили на бидистиллированной воде в разведении 1:10). Контрольные пробы готовили аналогично опытным, с той разницей, что вместо 0,1 мл 1 мМ раствора NADPH+H+ вносили 0,1 мл бидистиллированной воды. Кроме того, исследовали бессубстратное окисление NADPH+H+ в реакционной системе, содержавшей 0,3 мл воды вместо 0,3 мл водного раствора аргинина. Опытные пробы спектрофотометрировали против контрольных при 340 нм (максимум поглощения NADPH+H+), инкубировали 20 мин при 40°С, реакцию останавливали внесением в пробы 0,02 мл 0,02 % водного раствора натрия азида и регистрировали убыль экстинкции при 340 нм. Активность NOS выражали в нмоль NADPH+H+, окисляемого в течение 1 мин на 1 мг белка. Влияние ДДТ на активность NOS in vitro изучали в реакционных системах, содержащих в качестве ферментного препарата гомогенат печени контрольных крыс (именно печень содержит одновременно все три изоформы NOS [1]). Конечная концентрация аргинина составляла 32 мкМ, вместе с буфером в реакционную систему вносили по 4, 16 и 64 мкг ДДТ (количество ДДТ, вносимого в реакционные системы, рассчитывали исходя из доз ДДТ, вводимых в организм крыс в опытах in vivo). Кинетику влияния ДДТ на активность NOS изучали при конечных концентрациях аргинина — 4, 8, 16 и 32 мкМ и количестве ДДТ в реакционной системе 64 мкг. Содержание цитохрома Р-450 в печени, легких и головном мозге крыс определяли методом дифференциальной спектрофотометрии [10]. Активность ксантиноксидазы определяли описанным нами ранее методом [11]. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с t-критерием Стьюдента [12]. Результаты и их обсуждение Исследование активности NOS в печени, легких и головном мозге крыс in vivo показало, что ДДТ ингибирует данный фермент (рис. 1—3). Зависимость скорости nos реакции от концентрации субстрата в печени, легких и головном мозге опытных и контрольных крыс, отраженная в координатах Лайнуивера-Бэрка, показывает, что ДДТ вызывает либо снижение количества активной nos в печени, легких и головном мозге, либо неконкурентное ингибирование ее активности (Кm в обоих случаях остается постоянной, а vmax nos реакции в печени, легких и головном мозге крыс, получавших ДДТ, достоверно снижено по сравнению с vmax данной реакции в соответствующих органах контрольных животных, см. таблицу. Эксперименты показали, что ДДТ является ингибитором NOS (рис. 4), по данным кинетики ингибирования оно носит конкурентный характер (рис. 5). Константа ингибирования (Кi), рассчитанная методом Диксона [13], составила 9 мкМ. В данном случае ДДТ, очевидно, связывается с гемом (каталитическим центром) в структуре nos. Можно предположить, что ДДТ связывается с гемом в составе различных гемопротеидов и превращается при его участии в 1,1-дихлордифенилоксиацетат [7]. Полученные результаты о конкурентном ингибировании nos при участии ДДТ in vitro подтверждают, что in vivo ДДТ уменьшает количество активной nos, действуя на экспрессию соответствующих генов. Кроме того, возможна активация фосфорилирования еnos при участии ДДТ с последующим связыванием фермента с кальвеолярным белком кальвеолином-1, что приводит к конформационным изменениям в структуре nos c ингибированием ее каталитической активности [1]. В легких опытных крыс количество nos в 3,32 раза снижено по сравнению с контролем, а в печени и головном мозге — в 1,8 раза (рассчитывали исходя из того, что [nos]контр. / [nos]оп. = vmax контр. / vmax оп. [13]). Активность ксантиноксидазы в печени, легких и головном мозге крыс, получавших ДДТ, достоверно снижена по сравнению с контрольной группой (таблица). Механизм данного эффекта заключается в аллостерическом ингибировании ксантиноксидазы при участии ДДТ и обсуждался нами ранее [3]. Содержание цитохрома Р-450 в печени, легких и головном мозге опытных крыс достоверно повышено по сравнению с контрольной группой (таблица). Эти результаты подтверждают индукцию цитохрома Р-450 в легких при участии ДДТ. Первый механизм индукции цитохрома Р-450 при участии ДДТ состоит во взаимодействии последнего с ah-рецепторами, что индуцирует экспрессию соответствующих генов. Как видно из представленных нами результатов, ДДТ ингибирует ксантиноксидазу и снижает количество активной nos в печени, легких и головном мозге крыс, что тормозит образование ингибиторов экспрессии генов цитохрома Р-450 — супероксида [3], no и, соответственно, пероксинитрита. Таким образом, индукция цитохрома Р-450 ДДТ кроме того тормозит образование его ингибиторов. В этом, очевидно, заключается второй механизм индукции цитохрома Р-450 при участии ДДТ. Взаимодействия между nos, ксантиноксидазой и цитохромом Р-450, а также влияние ДДТ на их активность представлены на рис. 6. Итак, ДДТ является мощным изостерическим ингибитором синтазы оксида азота в опытах in vitro, а in vivo снижает количество активного фермента в печени, легких и головном мозге крыс, подавляя, скорее всего, экспрессию генов, кодирующих индуцибельную синтазу оксида азота, биосинтез которой регулируется стероидными гормонами и структурно родственными им веществами. ЛИТЕРАТУРА |