УДК 612,46-53:612.397:546.36

ТОКСИЧНІСТЬ І МУТАГЕННА АКТИВНІСТЬ ГРУНТУ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ — ЗАБРУДНЮВАЧІВ ГРУНТУ

Г.О. Іутинська, д.б.н., З.В. Петруша, В.А. Іваниця, д.б.н.,
Т.В. Васильєва, к.б.н., О.М. Сопліна

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ
Одеський державний університет ім. І.І. Мечнікова

Важкі метали, які потрапляють у грунт у вигляді різних хімічних сполук, можуть накопичуватись в ньому до високих рівней, що небезпечно для нормального функціонування грунтової біоти. У малих концентраціях метали, як мікроелементи, необхідні для нормальної життєдіяльності мікроорганізмів. У високих концентраціях важкі метали негативно впливають на структуру і функції природних екосистем, змінюють грунтовий біоценоз, функціонування якого підтримує родючість грунту. Під впливом важких металів відбуваються порушення в структурі комплексу грунтових мікроорганізмів, пригнічення їх біохімічної діяльності, інгібування активності цілого ряду ферментів — фосфатаз, протеаз, дегідрогеназ, інвертаз та ін. [2, 3].

Внаслідок зниження різноманітності і чисельності грунтових організмів зменшуються швидкість деструкції органічної речовини і кругообігу біогенних елементів [6].

Одним з небезпечних проявів негативного впливу важких металів на грунтову біоту є їх здатність впливати на мутаційний процес в клітині. Генетична небезпека забруднень зумовлена дією самих важких металів, а також продуктів їх трансформації. Тому при екологічному моніторингу для оцінки стану грунтів необхідно визначати рівень їх мутагенного фону і токсичності.

Серед великої кількості біотестів для оцінки мутагенних ефектів грунту в світовій практиці генетичних досліджень найчастіше використовують мікроорганізми: Salmonella typhimurium, E. coli [4]. Особливо важливе значення мають тест-об'єкти, які дозволяють одночасно реєструвати токсичну і мутагенну дію забруднень.

Метою наших досліджень було визначення токсичності і мутагенності забрудненого важкими металами грунту, а також вивчення ефективності різних меліорантів по знешкодженню такого впливу важких металів.

Матеріали та методи

Для токсикологічних і еколого-генетичних досліджень була використана бактеріальна модель — ауксотрофний штам Salmonella typhimurium TA 100. Методика [1] передбачала використання тест-об'єкту в стандартному фізіологічному стані. Для цього проводили культивування тест-організму в рідкому поживному середовищі з введенням досліджуваних агентів (дослід) і без них (контроль). Досліджували водні витяжки контрольного, забрудненого і меліорованого грунту (5 г сухого грунту + 25 мл дистильованої води) та водні витяжки (0,1 %) меліорантів — цеолітів білих, зелених, біогумусу, вермікуліту, 0,5 % КС-1 (колоїдного сорбенту).

Досліди проводили на темно-сірому опідзоленому грунті, в який вносили суміш солей важких металів Cd²⁺+Cu²⁺+Pb²⁺+Zn²⁺ у кількості, що дорівнювала 1, 10 і 20 ГДК. При цьому з розрахунку на 1 ГДК наважки становили: CdSO₄ — 5,56 мг/кг; CuSO₄ · 5H₂O — 11,8 мг; PbCl₂ — 26,8 мг та ZnSO₄ · 7H₂O — 101,12 мг/кг [5]. В контрольний грунт важкі метали не вносили.

На зазначеному вище забрудненому фоні вивчали ефективність дії неорганічних, органічних, біологічних і комбінованих меліорантів:
— неорганічні — цеоліти білий (3 т/га) і зелений (3 т/га), вермікуліт (0,5 т/га);
— органічний — біогумус (8 т/га);
— біологічний — культура Streptomyces alboviridis 141, стійка до високих доз важких металів і здатна вилучати їх з водних розчинів, виділена з сірого опідзоленого грунту у відділі загальної і грунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного. Меліорант застосовували у вигляді суспензії міцелію і спор культури титром 3·10¹⁰ колонійутворюючих одиниць (КУО) на 1 га;
— комбіновані — гіпс+ S. alboviridis 141, гіпс (2,1 т/га) з культурою Streptomyces alboviridis 141 (3·10¹⁰ КУО/га), а також КС-1— колоїдний сорбент (15 т/га) — сополімер на основі мікробного полісахариду — енпосану (20 %) і поліакриламіду (80 %).

Токсичність важких металів і грунту оцінювали відсотком інгібування росту тест-культури досліджуваним агентом. Мутагенну активність оцінювали кількістю зворотніх мутацій до прототрофності у ауксотрофного за гістидином штаму S. typhimurium TA 100.

Для вивчення токсичності 9 мл дослідного матеріалу вміщували в колбу і стерилізували його при 1 атм, додавали 0,1 мл добової культури S. typhimurium TA 100 (культивованої в МПБ при 37°С), 1 мл мінерального середовища М₉ і 0,1 мл розчину біотину і гістидину [1]. Культури вирощували на качалці протягом 5 год при 120 об/хв, 37°С.

Контроль містив культуру тест-мікроорганізму і всі компоненти, крім дослідного матеріалу.

Після інкубації проводили висів тест-об'єкту на тверді поживні середовища.

Токсичність визначали за різницею між кількістю життєздатних клітин сальмонели після культивування їх в середовищі, що містило дослідні агенти, і контролем. Для цього робили поверхневий висів 0,1 мл дослідного матеріалу на МПА і підраховували кількість життєздатних клітин за чисельністю колоній, що виросли. Для визначення мутагенної активності 0,1 мл дослідного матеріалу з додаванням м'якого агару і розчину біотину заливали другим шаром на тверде поживне середовище — бактеріальний агар (БА) [1].

Концентрацію мутацій клітин сальмонели розраховували за формулою:

К_м = (А_БА/А_МПА)·100 %,

де К_м — концентрація мутацій, А_БА — кількість клітин на БА, А_МПА — кількість клітин на МПА.

Мутагенну активність зразка характеризували за відносною концентрацією мутацій, яку розраховували за формулою:

К_відн = К_д/К_к ,

де К_відн — відносна концентрація мутацій, К_д — концентрація мутацій дослідного зразка, К_к — концентрація мутацій контролю.

Результати та їх обговорення

Токсикологічні дослідження показали, що природний (контрольний, незабруднений) темно-сірий опідзолений грунт не пригнічував ріст тест-мікроорганізму — Salmonella typhimurium TA 100.

Внесення суміші важких металів (Cu+Cd+Pb+Zn) у грунт спричинило токсичний вплив на клітини тест-мікроорганізму. Водна витяжка грунту, забрудненого важкими металами в дозах 1, 10 і 20 ГДК, пригнічувала ріст тест-культури на 45,60—78,31 % порівняно з контролем.

Мутагенна активність контрольного, незабрудненого грунту не перевищувала спонтанний рівень.

При експериментальному забрудненні грунту важкими металами в дозі від 1 до 20 ГДК мутагенна активність грунту зростала в 2,29—5,10 рази порівняно із спонтанним рівнем.

Дослідження ефективності заходів для зменшення негативного впливу забруднення грунту важкими металами на тест-мікроорганізм показало, що меліоранти не тільки сприяли зниженню токсичних властивостей забрудненого грунту, а й стимулювали ріст тест-культури (рис. 1). Так, при забрудненні грунту у дозі 1 ГДК чисельність життєздатних клітин тест-мікроорганізму збільшувалась у варіанті з цеолітом білим у 3,42 рази, цеолітом зеленим — у 4,66 рази, біогумусом — у 2,19 рази, вермікулітом — у 6,23 рази, культурою streptomyces alboviridis 141 — у 2,57 рази порівняно з контролем.

При дозі 10 ГДК кількість клітин тест-мікроорганізму збільшувалась у варіанті з цеолітом білим, біогумусом і гіпс+ S. alboviridis 141 у 1,16—1,20 рази, у варіанті з КС-1 — у 2,13 рази порівняно з контролем культури.

При більш високій дозі забруднення (20 ГДК) токсичну дію важких металів на тест-культуру знімав лише біогумус. Чисельність клітин тест-мікроорганізму на цьому варіанті була у 1,54 рази вищою, ніж у контролі культури.

Одночасно з токсикологічними дослідженнями було проведено визначення ефективності меліорантів по знешкодженню мутагенного впливу важких металів на грунт (рис. 2).

Встановлено, що при невисокій дозі забруднення (1 ГДК) всі досліджені меліоранти знешкоджували мутагенну дію важких металів. На меліорованих варіантах мутагенна активність грунту не перевищувала рівень спонтанних мутацій.

При більш високих дозах забруднення ефективність меліорантів зменшувалась. Так, при дозі забруднення 10 ГДК тільки застосування біогумусу і КС-1 знижувало мутагенність грунту до спонтанного рівня, а при дозі забруднення 20 ГДК максимальний демутагенний ефект реєструвався при внесенні у грунт біогумусу і гіпсу+S. alboviridis 141.

Таким чином, оцінка токсичності і мутагенності грунту, забрудненого важкими металами, показала, що природний темно-сірий опідзолений грунт Лівобережжя України не справляв токсичного і мутагенного впливу на тест-мікроорганізм — Salmonella typhimurium TA 100. Забруднення грунту сумішшю важких металів (Cu+Cd+Pb+Zn) в дозах 1, 10 і 20 ГДК спричинило токсичний і мутагенний вплив на тест-культуру. При забрудненні грунту в дозі 1 ГДК знешкоджували токсичну і мутагенну дію важких металів такі меліоранти, як цеоліт білий, цеоліт зелений, біогумус, вермікуліт і культура Streptomyces alboviridis 141. При високих дозах забруднення (10 і 20 ГДК) найбільш ефективними виявились біогумус, КС-1 і гіпс+ S. alboviridis 141. Ці меліоранти можуть бути застосовані для оздоровлення грунтів, забруднених важкими металами.

ЛІТЕРАТУРА
1. Васильева Т.В., Кожанова Г.А. Методические указания по использованию хлореллы для биотестирования качества водной среды. —Одесса: ОГУ,1989. —13 с.
2. Евдокимова Г.А. Микробиологическая активность почв при загрязнении тяжелыми металами // Почвоведение. —1982. —N 6. —С. 125—132.
3. Косинова Л.Ю. Изменение структуры микробоценозов и ферментативной активности некоторых почв под влиянием свинца и кадмия // Микробоценозы почв при антропогенном воздействии. —Новосибирск: Наука, 1985. —С. 29—47.
4. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхарда и др. — М., 1984. —Т. 2. —С. 48—64.
5. Санитарные правила и нормы охраны поверхностных вод от загрязнения. - М.: Минздрав СССР, 1988. —69 с.
6. Edwards C.A. The effects of contaminants on the structure and function of soil communities // 11 Int. Collog. Soil Zool., Jyvaskyla, 10—14 Aug., 1992: Program and Abstr. —Jyvaskyla, 1992. —P. 136.