|
МЕХАНИЗМЫ ИНТОКСИКАЦИЙ УДК 517.15.04;615.9;612.4.42 ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ДЕМЕТИЛИРУЮЩЕЙ И ДЕНИТРОЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМА Р-450 В ПРОЦЕССЕ АПОПТОЗА ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ КРЫС, ВЫЗВАННОГО N-НИТРОЗОДИМЕТИЛАМИНОМ Л.Н. Смердова, С.В. Сноз, к.б.н., Н.П. Дмитренко, д.б.н. Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя МЗ Украины, Киев Многие N-нитрозосоединения обладают выраженным цитотоксическим, мутагенным и канцерогенным действием [1, 2]. Для их реализации необходима метаболическая активация N-нитрозосоединений, которая осуществляется, главным образом, определенными изоформами цитохрома Р-450 посредством реакций деалкилирования и денитрозирования. Указанные токсические эффекты N-нитрозосоединений связывают с образованием из них в результате деалкилирования высокоактивных метаболитов типа диазоалканов, алкидиазония или карбониум-ионов, а также с усилением свободнорадикальных реакций ПОЛ, происходящих в микросомах. Денитрозирование же N-нитрозосоединений, сопровождаемое первичным образованием NО, рассматривается как путь их обезвреживания [1, 3—5]. Однако, данные последних лет указывают на то, что NО обладает выраженным цитотоксическим действием, приводящим к апоптозу различных клеток, в том числе и макрофагов. Оно опосредуется высокореактивными продуктами взаимодействия NО с супероксидным радикалом и перекисью водорода: пероксинитритом (NOO-) и гидроксильным радикалом (OH) [6—10]. Цитотоксическое действие и биотрансформация N-нитрозосоединений изучены преимущественно на гепатоцитах. В отношении макрофагов, выполняющих центральную роль в иммунитете и имеющих весьма активную систему цитохромов Р-450 [11], таких данных не обнаружено. Не известно также, как изменяется активность цитохромов Р-450 в процессе апоптоза клеток, хотя это очень важно знать для понимания характера метаболизма ксенобиотиков в организме в неблагоприятных условиях, когда частота случаев апоптоза клеток, в частности макрофагов повышена. В настоящей работе исследовано влияние N-нитрозодиметиламина (НДМА) на характер гибели, а также деметилирующую и денитрозирующую активность перитонеальных макрофагов крыс неактивированных и активированных введением вакцины БЦЖ в условиях модуляции активностей соответствующих изоформ цитохрома Р-450 и NО-синтазы. Материалы и методы Исследования были проведены на крысах линии Вистар массой 150—170 г. Животные были разделены на три группы: интактные, которым вводили интраперитонеально за 5—7 сут до декапитации вакцину БЦЖ в дозе 10 мг/кг массы тела, и крысы, которые на протяжении 3-х сут до эксперимента получали с питьевой водой 10% этиловый спирт. Перитонеальные макрофаги выделяли из брюшной полости крыс после декапитации, используя среду RPMI-1640 ("Sigma", США) [12]. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Полученную суспензию клеток разливали по 0,5 мл в 24-лунковые пластиковые планшеты, туда же добавляли по 75 ЕД пеницилина и стрептомицина, 5% инактивированную сыворотку телят и исследуемые эффекторы и инкубировали при 37°С с 5% СО2. Через каждый час инкубации проводили подсчет живых и мертвых клеток, окрашивая их трипановым синим. Определение N-деметилирующей и денитрозирующей активностей цитохромов Р-450 проводили, как описано нами раньше с модификациями [13]. Среда инкубации содержала: 50 мМ Tрис-HCl (pH 7,4), 10 мМ MgCl2, 0,4 мМ NADP+, 0,5 мМ глюкозо-6-фосфат, 0,5 мл лизата макрофагов и 100 мМ НДМA в конечном объеме 1 мл. Пробы инкубировали 30 мин на водяной бане при температуре 37°С при постоянном встряхивании. Реакцию останавливали приливанием 0,1 мл 0,3 М гидроксида бария и 20% ZnSO4. Контрольную пробу готовили или без NADPH-регенерирующей системы (NADP+ и глюкозо-6-фосфат), или без субстрата. После остановки реакции пробы центрифугировали при 200 g 5 мин и отбирали две аликвоты по 200 мкл супернатанта. К первой прибавляли по 0,02 мл 6,5 N соляной кислоты, 37,5 мМ сульфаниловой кислоты, 0,1% N-1-нафтилетилендиаминхлорида. Измерения проводили через 20 мин на фотометре "Яхонт-01" при 542 нм. Активность выражали в нмолях нитрита на 107 клеток за 1 ч инкубации. Во вторую пробу добавляли 0,02 мл реактива Nash (5 г солянокислого аммония и 0,1 мл ацетилацетона в 6 мл 3% уксусной кислоты) и ставили на водяную баню при 55°С на 10 мин. После охлаждения пробы измеряли при 414 нм на фотометре "Яхонт-01". Активность выражали в нмолях формальдегида на 107 клеток за 1 ч инкубации. Для определения количества формальдегида и нитрита в суспензии макрофагов отбирали аликвоты по 0,2 мл, к ним приливали 0,05 мл 0,3 М бария гидроксида и 20% ZnSO4 для осаждения белков, центрифугировали при 200 g 5 мин и отбирали супернатант. Дальнейшее определение проводили, как описано выше. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistika. Результаты и их обсуждение Из представленных рисунков видно, что НДМА вызывает гибель неактивированных и активированных БЦЖ перитонеальных макрофагов. Причем, количество мертвых клеток в культуре макрофагов, содержащей НДМА, со временем инкубации увеличивается. Это увеличение для активированных макрофагов имеет почти линейный характер. Неактивированные макрофаги проявляют большую чувствительность к цитотоксическому действию НДМА, чем активированные клетки. В течение первого часа инкубации количество мертвых клеток в культуре неактивированных макрофагов в 3 раза выше, чем среди активированных макрофагов. В последующее время инкубации нарастание количества мертвых клеток происходит одинаково как для неактивированных, так и активированных макрофагов. Известно, что макрофаги при действии химических факторов гибнут по апоптозному типу [14]. Для него характерно наличие латентного периода с момента воздействия токсического агента до видимых по внутриклеточному включению красителя проявлений гибели, неодинакового для различных типов клеток. Например, при вызываемом ионизирующим излучением и химическими факторами апоптозе тимоцитов, которые представляют относительно гомогенную популяцию клеток, он составляет 3—5 ч и четко отражается на кривых гибели этих клеток в течении 7 ч инкубации [14]. Учитывая характер полученных нами зависимостей гибели перитонеальных макрофагов, вызванной НДМА, от времени инкубации (рис. 1, 2), можно предположить, что фракции этих клеток являются гетерогенными и, в частности, отличаются скоростью протекания апоптоза. Среди неактивированных макрофагов доля более быстро гибнущих клеток выше, чем во фракции активированных макрофагов. Согласно данным литературы [15], введение крысам этанола приводит к индукции изоформ цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию нитрозосоединений в печени. Однако мы не обнаружили существенного изменения в денитрозирующей и деметилирующей НДМА активности перитонеальных макрофагов у крыс, получавших этанол (табл. 1). Не изменялся также и характер гибели макрофагов, полученных от этих животных под влиянием НДМА (рис. 2). Очевидно, цитохромы Р-450 перитонеальных макрофагов менее доступны и чувствительны к воздействию этанола по сравнению с печеночными клетками. Активация макрофагов сопровождается сложными метаболическими перестройками [16], поэтому наблюдаемую нами более высокую резистентность к НДМА активированных макрофагов по сравнению с неактивированными (рис. 1) трудно трактовать однозначно. Возможно, что она связана с активацией no-синтазы. При этом образующийся в больших количествах оксид азота может взаимодействовать с гемовыми участками цитохрома Р-450 и ингибировать его [17]. Действительно из табл.2 видно, что макрофаги, активированные инъекциями крысам вакцины БЦЖ, при инкубации в присутствии НДМА синтезируют no, определяемый по накоплению иона нитрита в среде инкубации клеток, более интенсивно по сравнению с неактивированными клетками. Этот синтез обусловлен активацией no-синтазы и не связан с денитрозированием НДМА, которое незначительно из-за низкой ее концентрации (1,3 нмоль/мл) в клеточной суспензии. Активация макрофагов существенно не сказывается на их денитрозирующей и деметилирующей активности. Но в процессе апоптоза, вызванного НДМА, отмечается более значительное снижение денитрозирующей активности в активированных макрофагах, чем при инкубации этих клеток в отсутствии НДМА. В тоже время в неактивированных клетках контрольных и принимавших с питьевой водой этанол животных она, наоборот, значительно возрастает, и это особенно заметно на фоне некоторого снижения активности при инкубировании макрофагов в отсутствии НДМА (табл. 1). Можно предположить, что в активированных макрофагах превалирующим фактором, ингибирующим соответствующую изоформу цитохрома Р-450, является гиперпродукция оксида азота, а в неактивированных клетках в процессе апоптоза преобладают иные метаболические процессы, приводящие к увеличению активности этого фермента, например, изменения в его конформации и связывающей субстрат способности. В пользу высказанного предположения о том, что устойчивость активированных макрофагов к токсическому действию НДМА выше, чем неактивированных, потому, что первые интенсивнее синтезируют оксид азота, можно отнести также следующие факты. Добавление в среду активированных макрофагов вместе с НДМА 2мМ аргинина, являющегося субстратом no-синтазы, уменьшает количество погибших через 6 ч инкубации клеток на 23% (от 35,1±0,6% до 27,8±0,4%), а в присутствии 0,5 мМ ковалентного акцептора no количество погибших клеток наоборот увеличилось на 20% и достигло 40,0±1,7%. Интересно, что у крыс, получавших этанол, в перитонеальных макрофагах значительно снижен синтез NO (табл. 2). Возможно, это одна из причин, обусловливающих снижение функции макрофагов и иммунитета при потреблении алкоголя. Добавление в среду инкубации макрофагов 2 мМ пиразола- известного ингибитора изоформ цитохрома Р-450, ответственного за биотрансформацию N-нитрозосоединений в клетках печени [18], вызывает угнетение денитрозирующей НДМА активности у контрольных и иммунизированных БЦЖ крыс на 72%, а деметилирующей НДМА активности на 36 и 32% соответственно (табл. 3). При этом существенно снижается чувствительность неактивированных перитонеальных макрофагов контрольных и получавших этанол крыс к цитотоксическому действию НДМА. На активированных макрофагах такого эффекта не наблюдается (рис. 1, 2). Очевидно, активность цитохромов Р-450 в этих клетках заингибирована оксидом азота так, что дополнительное действие на них пиразола не проявляется. Деметилирующая активность неактивированных макрофагов контрольных и получавших этанол крыс в процессе индуцированного НДМА апоптоза не изменяется, а в активированных макрофагах она, по сравнению с клетками инкубируемыми в отсутствии НДМА, существенно возрастает (табл. 1). Полученные данные указывают на то, что меньшая чувствительность активированных макрофагов к цитотоксическому действию НДМА, чем неактивированных макрофагов, связана со снижением денитрозирующей, а не с наблюдаемыми изменениями деметилирующей активности. В процессе инкубации исследуемых макрофагов в присутствии НДМА поддерживаются постоянные уровни формальдегида в клеточной суспензии, что указывает на наличие динамического равновесия между синтезом и утилизацией этого соединения. Вместе с тем, превращение формальдегида, который образуется из НДМА в макрофагах, полученных от контрольных, иммунизированных БЦЖ и потреблявших этанол животных, имеет свои особенности. Поэтому концентрации формальдегида в клеточных суспензиях контрольных, иммунизированных БЦЖ и потреблявших этанол животных достоверно отличались друг от друга и составляли соответственно 3,01±0,41, 1,45±0,19 и 4,46±0,42 нмоль на 107 кл (М±m; n — 6—7). Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что способность N-нитрозодиметиламина вызывать гибель перитонеальных макрофагов связана с его биотрансформацией, в частности, денитрозированием цитохромом Р-450 и состоянием метаболизма оксида азота. В процессе гибели макрофагов денитрозирующая и N-деметилирующая активности цитохрома Р-450 претерпевают изменения, имеющие свои особенности в зависимости от функционального состояния (активированные БЦЖ или нет) клеток и влияния на их обмен этанола. ЛИТЕРАТУРА |