|
ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ УДК 582.288-11+577.18 МИКОТОКСИНЫ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ В.В. Смирнов, акад. НАН Украины, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного Среди многочисленных факторов окружающей среды токсические вещества — микотоксины, образуемые микроскопическими грибами, в последнее время привлекают все большее внимание. С одной стороны, — токсигенные грибы чрезвычайно широко распространены в природе, и при благоприятных условиях (повышенные влажность, температура) они могут поражать различные пищевые, кормовые, производственные вещества и наносить существенный урон народному хозяйству. С другой стороны, — потребление продуктов и кормов, контаминированных этими грибами и микотоксинами, может сопровождаться тяжелыми заболеваниями человека и сельскохозяйственных животных — микотоксикозами — достаточно хорошо описанными в литературе [1, 17]. В отличие от микозов — заболеваний, связанных с прямой инвазией патогенных микромицетов, микотоксикозы человека и животных обусловлены действием только микотоксинов. С учетом изложенного, предметом микотоксикологии как науки являются микотоксины и микотоксикозы, хотя микотоксикология — наука мультидисциплинарная, которая зародилась на стыке микробиологии, токсикологии, патологии растений и животных, фармакологии, биохимии, аналитической и органической химии, и др. дисциплин. Определить понятие микотоксины весьма сложно, поскольку их действие не ограничивается только влиянием на животных и человека, а распространяется также на растения, простейших, насекомых, микроорганизмы, вирусы, то есть понятие микотоксины интерферирует с понятием антибиотики, которые, в свою очередь, оказывают действие не только на микроорганизмы. Введение "дозовых нормативов" мало чем помогает определению понятия микотоксины. Микотоксины являются важнейшими вторичными метаболитами микроскопических грибов, которые в течение последних 35–40 лет признаны одними из наиболее вредных для здоровья человека и животных агентов. И не случайно микотоксины введены в перечень регламентированных в пищевых продуктах, кормах и сырье веществ. В настоящее время науке известно около 200 видов микромицетов, образующих свыше 400 микотоксинов, и число их, по-видимому, в ближайшие годы будет пополняться за счет установления этиологии новых микотоксикозов [9]. Для многих из микотоксинов установлена структура, изучены свойства и биохимический механизм действия, разработаны методы выделения, идентификации и количественного определения. К их числу относятся афлатоксины, охратоксины, патулин, цитринин, зеараленон, трихотеценовые микотоксины. Учитывая, что микотоксины, помимо общетоксического действия, обладают мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами, а также существенно влияют на иммунный статус теплокровных их следует рассматривать как одну из важнейших медицинских проблем. Потенциальная и реальная опасность микотоксинов значительно усиливается их высокой стабильностью к различным неблагоприятным воздействиям, как-то: кипячение, обработка минеральными кислотами, щелочами и другими агентами. География распространения микотоксинов охватывает большинство стран всех континентов, контаминации микотоксинами подвержены все основные продукты питания, корма, продовольственное сырье, а интенсивные торговые связи между различными странами в значительной степени способствуют распространению как микотоксинов, так и микотоксикозов, и есть все основания полагать, что эта проблема является глобальной. Классифицируются микотоксикозы по преимущественному поражению тех или иных органов или систем [5]. Так, к нейротоксикозам относят эрготизм (Claviceps purpurea), микотоксикозы, сопровождающиеся тремором (Aspergillus fumigatus и др.), сердечную форму бери-бери связывают с действием цитреовиридина (Penicillium citrеo-viride). Гепатоксикозы включают преимущественно довольно редкие случаи острых афлатоксикозов (Asp. flavus, Asp. parasiticus), синдром Рейя, циррозы печени, которые, как считают, вызываются циклохлоротином (P. islandicum). К нефротоксикозам относят Балканскую нефропатию, в этиологии которой прослеживается связь с охратоксином А (Asp. ochraceus). К токсикозам с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта и кроветворных органов относят алиментарную токсическую алейкию (АТА), причинным агентом которой являются главным образом токсины Fusarium sporotrichiella. Самостоятельный тип составляют дерматоксикозы и респираторные микотоксикозы (Stachybotrys chartarum, Dendrodochium toxicum, Myrothecium verrucaria и др.). Предполагают, что зеараленон (F-2 токсин), обладающий эстрогенным эффектом, может быть причиной наблюдавшихся случаев раннего полового созревания и изменения вторичных половых признаков (F. graminearum). Некоторые формы рака (первичный рак печени, легких, пищевода) также могут быть связаны с наличием микотоксинов в пищевых продуктах. Существующие классификации микотоксинов основаны преимущественно на их химической природе. Среди микотоксинов встречаются не только вещества белковой природы, а и глюкозиды, стероиды, поликетиды, сесквитерпеноиды, различные гетероциклы, полисахариды, органические кислоты, макролидные структуры и т. п. Многообразие химических структур микотоксинов [17] затрудняет оценить пути их биогенеза (рисунок). Однако при более детальном рассмотрении оказывается, что они синтезируются из довольно ограниченного числа продуктов основного метаболизма, таких как ацетат, мевалонат, некоторые аминокислоты путем конденсации, окисления, восстановления, алкилирования, циклизации. В настоящее время хорошо изучено 5 основных путей биосинтеза микотоксинов [20]: Характерной особенностью продуцентов микотоксинов является их способность синтезировать семейства микотоксинов. Эта особенность хотя и не является для них уникальной, поскольку широко распространена среди микроорганизмов, образующих антибиотики, до настоящего времени не нашла убедительного объяснения. Образование семейств микотоксинов, незначительно различающихся по строению и физико-химическим свойствам, определяет исключительную сложность выделения многих их них. Данные, приведенные в таблице, на примере макроциклических трихотеценов (МЦТЦ), дают представление о способности различных штаммов грибов синтезировать эти вещества. Многообразие структур, образуемых тем или иным штаммом, с одной стороны, — значительно усложняет клиническую картину микотоксикозов, а с другой, — может служить иллюстрацией возможной многовекторности биологических эффектов микотоксинов. О современном состоянии микотоксикологии можно судить по многочисленным оригинальным публикациям, посвященным главным образом изучению распространения токсинообразующих грибов и их токсигенного потенциала, химической природы микотоксинов, методов их определения и биологических свойств. Эти сведения обобщены в ряде монографических работ [1, 17]. Настоящая работа ставит своей целью рассмотреть некоторые фундаментальные и прикладные аспекты проблемы, которые, как нам кажется, не нашли должного освещения, либо вообще остались вне поля внимания исследователей. Микотоксины и микроорганизмы Одним из наиболее характерных свойств большинства известных микотоксинов является их антимикробная активность. И не случайно многие из них первоначально обнаруживались при поиске антибиотических веществ. Примером этого могут служить цитринин, пеницилловая кислота, патулин, микофеноловая кислота, трихотецин и др. Антибиотические свойства различных микотоксинов изучались многими исследователями [2, 3, 14, 24, 26]. При этом в большинстве случаев так или иначе рассматривались прикладные аспекты. Однако с учетом высокой токсичности нативных веществ данного класса представляется маловероятным их использование в качестве антибиотиков. Анализ ранее выполненных работ [3], с нашей точки зрения, дает возможность выявить некоторые другие стороны практического использования этого свойства. Существующие химические методы как выделения, так и определения микотоксинов подчас исключительно сложны, трудоемки и не отвечают запросам массового анализа. Биологические методы, к сожалению, не всегда достаточно специфичны или же требуют большого числа лабораторных животных. Инструментальные же методы, при видимой их привлекательности, требуют высококвалифицированного обслуживания и значительных затрат времени на предварительную подготовку образцов. К тому же они очень дорогостоящие [26]. В этой связи представляется перспективной разработка методов микробиологической индикации микотоксинов, основанных на использовании высокочувствительных и высокоспецифичных тест-культур. Особенно актуальной представляется разработка таких методов в условиях регламентации ряда микотоксинов в пищевых продуктах, кормах, продовольственном сырье, когда частота встречаемости этих веществ невысока, а затраты на стандартизованные химические методы анализа непомерно высоки. Именно здесь простой и доступный микробиологический метод предварительной оценки безопасности пищевых и кормовых субстратов может оказаться весьма полезным в обеспечении профилактики алиментарных микотоксикозов человека и животных. Однако разработка микробиологических методов, в настоящее время с успехом используемых в других сферах человеческой деятельности, становится возможной лишь при наличии соответствующего банка тест-организмов, формируемого на основании изучения антибиотических свойств микотоксинов в отношении широкого набора штаммов микроорганизмов из различных таксономических групп. В результате такого исследования могут быть выявлены штаммы микроорганизмов, устойчивые к микотоксинам, другими словами, обладающие способностью метаболизировать или трансформировать эти вещества, что, в свою очередь, открывает перспективы разработки биологических методов инактивации микотоксинов в различных субстратах. Представляет интерес также использование специфической чувствительности или устойчивости к отдельным микотоксинам у представителей различных таксонов микробного мира в качестве возможного таксономического признака при их дифференциации [2]. Хотя этот аспект проблемы ранее не рассматривался, с учетом уникальности структур многих микотоксинов, он представляется нам исключительно интересным. Изучение антибиотических свойств микотоксинов на широком наборе культур с различной чувствительностью открывает перспективу использования их в качестве удобных и доступных модельных систем для исследования биохимических механизмов действия. Повсеместное распространение микотоксинов, в том числе и в продуктах питания человека, создает прецедент отрицательного воздействия этих веществ на его резидентную микрофлору с развитием дисбактериозов. В этой связи крайне необходимыми являются исследования взаимоотношений микрофлоры человека и микотоксинов как вероятной причины многих патологий. Приуроченность многих токсинобразующих грибов к определенным типам почвы свидетельствует о том, что в реальных условиях они могут отрицательно влиять на биологическое равновесие в почве, как одной из составляющих урожайности. Микотоксины и растения Способность многих фитопатогенных грибов к образованию микотоксинов дает основание рассматривать последние в качестве факторов вирулентности. С другой стороны, — микотоксины очень часто проявляют фитотоксические свойства и в очень низких концентрациях (10-5–10-6 М) вызывают симптомы увядания, хлорозы, некрозы большого числа растений [7, 8]. Так, например, некоторые простые трихотецены (Т-2 токсин, дезоксиниваленол — ДОН) ингибируют рост колеоптилей пшеницы, а более сложные (МЦТЦ) вызывают хлорозы и некрозы на листьях дыни. При этом трихотеценовые микотоксины часто обнаруживаются в тканях растений, инфицированных фитопатогенами. Вместе с тем попытки выявить микотоксины в больных растениях не всегда были успешными. Однако, как считают некоторые исследователи [8, 27], данный факт не может свидетельствовать в пользу отрицания их роли в патогенезе, поскольку может быть связан с нестабильностью этих метаболитов, либо их инактивацией ферментами растения. Все же, несмотря на наличие альтернативных суждений, прослеживается четкая коррелятивная связь между способностью фитопатогенов синтезировать микотоксины и их вирулентностью. Нельзя не согласиться с мнением [8, 16], что взаимоотношения "фитопатоген — растение" в такой же мере сложны, как и интегрированы. И если представить себе, что фитопатогенные грибы синтезируют микотоксины для усиления их вирулентных свойств, то в такой же мере правомочно предположение о наличии в растении механизмов, ограничивающих эффект этих метаболитов. К сожалению, такие механизмы остаются слабо изученными. Тем не менее, из сложности взаимоотношений "фитопатоген — растение" можно извлечь практические выгоды. Образование микотоксинов может быть ограничено путем поиска синтетических или природных ингибиторов этого процесса, а также конкурентноспособных штаммов, не образующих микотоксины, либо штаммов-антагонистов. В качестве возможного механизма защиты может служить селекция устойчивости к фитопатогену. Это направление представляется наиболее перспективным, поскольку решает помимо чисто хозяйственных задач, связанных с урожаем, и ряд экологических (снижение нагрузки химических средств защиты растений на окружающую среду). Особый интерес вызывает селекция устойчивости на клеточном уровне при использовании в качестве селективных агентов тех же микотоксинов. Имеются успешные попытки такой селекции, выполненные рядом исследователей [15, 23]. Такой подход, как нам кажется, имеет существенные преимущества перед генно-инженерными разработками, требующими значительных материальных затрат и часто непредсказуемых по отдаленным результатам. Положительный опыт, очевидно можно было бы извлечь из познания механизмов устойчивости к МЦТЦ некоторых бразильских кустарников, — Baccharis megapotamica и B. coridifolia, которые обладают способностью сорбировать тысячи долей на миллион веррукарина А и роридина А, токсичных для большинства изученных сельскохозяйственных растений в концентрациях порядка нескольких частей на миллион [7, 10, 13]. Микотоксины и иммунитет Еще в 1913 году в Сибири была открыта пищевая интоксикация людей, в последствии описанная как алиментарная токсическая алейкия (АТА). Вспышки этого заболевания отмечались и в последующие годы и характеризовались прогрессивной лейкопенией, гранулоцитопенией и умеренным лимфоцитозом. Нарушения крови, характерные для первой и второй стадий, усугублялись в третьей и сопровождались подавлением иммунной системы. При этом смертность достигала 60% [1, 17]. АТА у людей и животных связана с поеданием зерна, перезимовавшего под снегом и контаминированного токсигенными штаммами F. sporotrichiodes и F. poae — известными продуцентами ряда трихотеценовых микотоксинов. Иммунодепрессивный эффект этих веществ, как и многих других микотоксинов, впоследствии неоднократно подтверждался. В последние годы проблема иммунодепресивного эффекта микотоксинов вызывает особый интерес, определяемый не только все возрастающей контаминацией различных субстратов микотоксинами, а и более высокой повреждаемостью и пролонгированностью нарушений в сравнении с действием других факторов. Нельзя при этом не принимать во внимание действующий в условиях Украины и ряде других стран "синдром Чернобыля". Эта проблема не может быть ограничена только чисто медицинскими аспектами, а должна также включать и социальную сферу, поскольку в условиях снижения жизненного уровня опасность распространения инфекционных, аллергических, онкологических и других заболеваний резко возрастает. Следовательно, изучение дефектов иммунной системы как функции микотоксинов является одним из важнейших условий для разработки эффективных средств защиты. Нарушение иммунологических реакций под влиянием микотоксинов обычно рассматривается дифференцированно для клеточного и гуморального звеньев, поскольку они обусловлены наличием 2-х самостоятельных популяций главных иммунокомпетентных клеток: Т- и В-лимфоцитов. Так, Thaxton [25] и Pier [18] обнаружили угнетение антителогенеза при обработке бройлерных цыплят афлатоксином В1. Каждая из исследуемых доз в пределах 0,625–10,0 мг/г, задаваемая с кормом, достоверно снижала титр гемагглютининов, образующихся при иммунизации цыплят эритроцитами барана. При этом степень снижения титра антител зависела от дозы афлатоксина и продолжительности кормления. Было также показано, что под влиянием афлатоксина В1 у индюшат и цыплят уменьшается вес тимуса и фабрициевой сумки на 60 и 25%, соответственно, а также снижается их резистентность к возбудителям холеры, сальмонеллезам, некоторым микозам. На основании результатов этих экспериментов авторы предполагают, что афлатоксин В1 не просто ослабляет иммунитет у птиц, но и нарушает сам процесс индукции иммунного ответа. Для других микотоксинов отмечено различное действие на гуморальный иммунитет. Так, под влиянием трихотецина и stach-токсина, вводимых мышам внутрибрюшинно в дозе 2–4 мг/кг перед иммунизацией эритроцитами барана, отмечалось снижение титра гемагглютининов. В то же время охратоксин, скармливаемый морским свинкам в дозе 0,45 мг/день в течение 4-х недель, не угнетал иммунный ответ по отношению возбудителей бруцеллеза. Т-2 токсин, скармливаемый цыплятам в дозе 16 мкг/г рациона, снижал их резистентность к различным видам сальмонелл, вызывающих у цыплят паратиф. Однако рубратоксин не нарушал резистентности индюшат к возбудителям холеры домашней птицы [21, 22]. Показано также [19], что у самцов мышей линий CD-1, которым внутрибрюшинно вводили цитринин в дозах от 0 до 3 мг/кг через день в течении 2–4 недель, масса тела и органов не изменялись, хотя почки при этом увеличивались. Цитринин стимулировал пролиферацию лимфоцитов селезенки. Образование антител клетками селезенки у животных, сенсибилизированных эритроцитами барана, возрастало при использовании более высоких концентраций токсина. Предполагают, что цитринин обладает способностью стимулировать иммунную систему и в то же время не оказывает существенного иммунотоксического эффекта в испытанных дозах. При изучении состояния здоровья людей, работающих в условиях "больных зданий", инфицированных спорами S. chartarum, содержащими стахиботриотоксины, было показано, что наряду с обострением хронических заболеваний содержание зрелых Т-хелперов и Т-супрессоров было существенно ниже, чем в контроле. В то же время, уровень ранних В-клеток и киллеров был выше. Тесты на наличие специфических антител к S. charta-rum не обнаруживали существенных различий между контролем и опытом. Авторы [11, 12] связывают ухудшение состояния здоровых пациентов с нарушением системы клеточного и гуморального иммунитета, вызванных продолжительным контактом со спорами токсигенных штаммов. Таким образом действие микотоксинов характеризуется иммунодепрессивным эффектом на гуморальный ответ, однако их влияние на реакции иммунитета оказалось более сложным, нежели простое подавление выработки антител. Наряду с описанными фактами влияния микотоксинов на реакции гуморального иммунитета, Richard et al. [21, 22] сообщают об изменении под действием микотоксинов фагоцитоза. Так, афлатоксин, вносимый в рацион цыплят в дозах от 0,625 до 5,0 мкг/г в течение 3-х недель, подавлял фагоцитоз коллоидного угля, вводимого птицам внутривенно. Обнаружено также торможение фагоцитоза альвеолярными макрофагами кроликов, получавших афлатоксин в дозе 0,03–0,09 мг/день на протяжении 2-х недель, а цитохалазин В в концентрации 0,5–5,0 мкг снижал фагоцитоз золотистого стафилококка альвеолярными макрофагами кролика и базофилами человека. Возможной причиной нарушения фагоцитоза может быть подавление активности комплемента, принимающего значительное участие в этом процессе. Сравнительно недавно получены данные о влиянии афлатоксина на иммунокомпетентные клетки in vitro. Так было показано, что афлатоксин В1 в концентрации 10–20 мг/мл подавляет стимуляцию периферических лимфоцитов митогеном лаконоса. При этом жизнеспособность клеток практически не изменялась. Как уже отмечалось, снижение массы центральных органов иммунной системы — тимуса и фабрициевой сумки — при скармливании афлатоксина птицам не равнозначно. Инволюция тимуса у индюшат выражена значительнее и составляет свыше 60% массы органа. Афлатоксин in vitro подавляет трансформацию периферических лимфоцитов человека, вызванную неспецифическим митогеном фитогемагглютинином (РНА) и специфическими антигенами: ППД (очищенным безбелковым туберкулином) и возбудителем паротита. Афлатоксин в концентрации 5 мкг/мл на 54% подавлял включение меченного тимидина культурой лимфоцитов, стимулированных РНА. Интересно, что ингибирующее действие афлатоксина проявлялось только при 20-часовом сроке его инкубации с культурой лимфоцитов; при более коротких сроках инкубации подавляющий эффект афлатоксина оказывался обратимым и мог быть устранен отмыванием лимфоцитов средой выделения. Иммунодепрессивное действие афлатоксина in vitro было показано также на культуре лимфоцитов, стимулированных неспецифическими фитомитогенами, фитогемагглютинином, конканавалином А и др. Таким образом, афлатоксины, охратоксин А и многие трихотеценовые микотоксины (Т-2 токсин, диацетоксисцирпенол, фузаренон-Х, стахиботриотоксин и др.) обладают способностью модифицировать иммунные реакции организма. Микотоксины обладают способностью проходить плацентарный барьер и оказывать тератогенное действие. Молодые животные вообще являются более чувствительными к действию микотоксинов и повреждения их иммунной системы, как правило, выражены сильнее. В некоторых случаях, это действие является обратимым, в других — более пролонгировано. В случае охратоксина А многие вредные эффекты можно предотвратить фенилаланином. К сожалению, пока мы не знаем других способов предупреждения иммунодепрессивного действия микотоксинов. Обратимость воздействия афлатоксинов на клеточный и гуморальный иммунитет хорошо коррелирует с феноменом обратимого ингибирования ими синтеза ДНК и РНК. Такой характер нарушения обмена нуклеиновых кислот может явиться основой мутаций и злокачественного перерождения клеток. Микотоксины и лекарства Как отмечалось ранее, открытие микотоксинов было связано с поиском веществ, обладающих антибиотическими свойствами. Однако, лишь немногие из них нашли применение в практике (триходермин, трихотецин, гризеофульвин, микофеноловая кислота и др.), хотя спектр антимикробного действия ряда микотоксинов обнадеживал. Так, триходермин был рекомендован для обработки Candida albicans у людей, для контроля фузариозных гнилей картофеля и других фитопатогенных грибов [6]. Главным препятствием использования микотоксинов в качестве антибиотических веществ является их довольно высокая токсичность. По-видимому, можно получить производные с высокой антибиотической активностью и низкой токсичностью. Более перспективным представляется использование цитостатической активности многих микотоксинов, в частности трихотеценов. Так, веррукарин А имеет LD50 для культивируемых мышиних клеток линии Р-815 0,6 нг/мл. При этом чувствительность делящихся клеток была значительно выше. Хорошо известна также цитотоксическая природа триходермина, диацетоксисцирпенола, трихотецина, фузаренона-Х, Т-2 токсина и др. Значительные инвестиции в некоторые крупные фармацевтические фирмы были вызваны надеждой получения противоопухолевых агентов, однако до последнего времени никаких клинически полезных лекарств на базе трихотеценов не удавалось получить. И лишь недавние исследования американских ученых по синтезу и химической модификации трихотецинов позволили получить производные с антинеопластической активностью и сравнительно низкой токсичностью. Так, Jarvis et Mazzola [10] испытывали многие производные веррукаринов и роридинов, наряду с их производными из растений — бакхаринами, на активность против мышиной лейкемии Р-388. Для большинства бакхариноидов было характерно высокое Т/C-отношение (дни выживания опытных животных : дни выживания контрольных животных x 100) и, как считают авторы, оно было обусловлено замещением атома кислорода в кольце А веррукарина А и роридина А. В дальнейшем было показано, что введение b-9,10-эпоксида в кольцо А веррукарина и роридина А существенно увеличивало отношение Т/С для этих веществ. Следует отметить также, что значительное ингибирование синтеза белка трихотецинами связывают с энергией проникновения этих веществ при местном применении, что делает их идеально подходящими для обработки вирусных инфекций, например, при удалении бородавок. Высокая иммунодепрессивная активность некоторых микотоксинов позволяет надеяться на возможность использования их в области трансплантации. Об успешной попытке использования Т-2 токсина с этой целью в опытах на собаках сообщают Шатерников и Марокко [4]. Заключение Приведенные выше данные свидетельствуют, что наши знания в области микотоксинов за последние 25–30 лет шагнули далеко вперед, однако нельзя с уверенностью сказать, что эта проблема стала менее актуальной. Об этом говорит и круг поднятых нами вопросов, решение которых будет способствовать прогрессу этой важной области медицины и биологии. ЛИТЕРАТУРА |