УДК 615.9.616.36-099:576.2.24:577.161.3

ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИОКСИДАНТНИХ І ГЕПАТОПРОТЕКТОРНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ КОМПОЗИЦІЇ "МЕТАВІТ" ЗА УМОВ ГОСТРОГО ОТРУЄННЯ АЦЕТАМІНОФЕНОМ

А.К. Вороніна, В.М. Коваленко, д.б.н., Г.М. Шаяхметова,
Ю.М. Пархоменко, д.б.н.

Інститут фармакології та токсикології АМН України
Інститут біохімії НАН України ім. О.В. Палладіна

Парацетамол (ацетамінофен, АФ) широко використовується в якості анальгетичного та антипіретичного засобу і є відносно безпечним при прийомі в терапевтичних дозах.

Разом з тим, не лише передозування АФ [1], але й застосування його за ряду умов (гострі та хронічні ураження печінки [2], неінсулінзалежний діабет, низький за вмістом білків раціон [3], вживання алкоголю [4] та ін.) здатні викликати некрози печінки людини та тварин різних видів [5]. Показано, що відповідальним за гепатотоксичну дію АФ є реактивний метаболіт — N-ацетил-р-бензохінонімін (NAPXІ), який утворюється із залученням цитохромів Р-450 2Е1 та 1А2 і ковалентно звўязується з сульфгідрильними групами білків та глутатіону переважно в центролобулярних зонах печінки [6].

Оскільки детоксикація NAPXІ здійснюється за допомогою реакцій хімічної та ферментативної конўюгації з глутатіоном при передозуванні АФ, рівень його в печінці зменшується [7]. Це, в свою чергу, може привести до порушення антиоксидантного статусу організму і активації окислення та переокислення біосубстратів печінки, що мало б усугубити токсичну дію NAPXІ.

Виходячи з вищесказаного, метою даної роботи було дослідити вплив передозування АФ на деякі показники перекисного окислення в печінці та можливість корекції його порушень за допомогою композиції "Метавіт", розробленої в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Дослідження проводили на білих щурах-самцях лінії Вістар з масою тіла 160—170 г, які були розділені на чотири групи: 1 — інтактні тварини; щурам 2–4 груп протягом двох діб перорально вводили АФ в дозі 1250 мг/кг маси тіла (1/2 DL₅₀) у вигляді суспензії в 2%-ному крохмальному гелі; 2 — неліковані щури (контроль); тваринам 3-ї (дослід 1) та 4-ї (дослід 2) груп одночасно з АФ внутрішньошлунково вводили відповідно досліджувану композицію "Метавіт" та препарат порівняння — метіонін в дозі 25 мг/кг маси тіла.

Через 24 год після останнього введення АФ щурів умертвляли методом цервікальної дислокації, вилучали печінку, з якої готували 10%-ний гомогенат в 0,05 М трис-НСІ буфері з рН 7,4. Мітохондріальну та мікросомальну фракції печінки одержували за методом [8]. Всі процедури виконували з дотриманням холодового режиму (t=4°С).

Вміст відновленого глутатіону в гомогенаті печінки досліджували за рівнем SH-груп з використанням реактиву Еллмана [9].

Швидкість утворення супероксид аніона визначали в мітохондріях печінки спектрофотометрично за швидкістю відновлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу (ДХФІ), використовуючи метод [10]. Активність каталази визначали за методом [11]. Вміст гідропероксидів ліпідів в мітохондріальній фракції печінки вимірювали, як вказано в роботі [12].

Стан процесів перекисного окислення в мікросомальній фракції печінки оцінювали за швидкістю індукованого аскорбіновою кислотою та НАДФН накопичення продуктів взаємодії з тіобарбітуровою кислотою [13].

Активність маркерів цитолізу гепатоцитів аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрасферази (АсАТ) та лужної фосфатази (ЛФ) визначали у сироватці крові, користуючись біотестами фірми Lachema (Чехія). Вміст білка у гомогенаті та субклітинних фракціях печінки визначали за методом Лоурі [14].

Статистичну обробку отриманих даних проводили з використанням критерію Стьюдента.

Глутатіон має нуклеофільну тіолову групу і здатний знешкоджувати речовини трьома способами: коньюгацією за участю глутатіонтрансферази, хімічною взаємодією з метаболітами, а також, як донатор протону або атому водню реактивного інтермедіанту, або вільному радикалу, відповідно. Вміст глутатіону в печінці нормальних щурів досить високий — 3,405±0,362 мкмоль/г тканини (табл.1). Пероральне введення АФ в дозі 1/2 dl₅₀ викликає зниження рівня глутатіону на 30% порівняно з вмістом в печінці інтактних щурів, що може бути наслідком виходу конўюгатів і збіднення пулу даного трипептиду. Введення полівітамінної композиції "Метавіт" одночасно з АФ запобігає зниженню рівня глутатіону, більше того, вміст його в печінці за цих умов зростає майже на 28% порівняно з інтактною групою, значно перевищуючи ефективність препарату порівняння — метіоніну (p< 0,05).

Цікаво відмітити, що попри недостатність даних літератури щодо ролі процесів вільнорадикального окислення в патогенезі токсичної дії АФ, нами встановлено, що рівень супероксиданіону в мітохондріях печінки при отруєнні АФ зростає майже в 1,5 рази (табл.1). Одночасно каталазна активність печінки падає в 1,8 рази. Це призводить до накопичення гідропероксидів та активації процесів ліпопереокислення. Застосування "Метавіту" практично приводить дані показники до рівня інтактних тварин.

Дослідження гідропероксидів ліпідів виявило зростання їх кількості в мембранах мітохондрій отруєних тварин в 2,3 рази у порівнянні з інтактною групою. Введення досліджуваної композиції призводить до зниження цього показника в 3 рази порівняно з контрольною групою щурів.

Дані щодо індукованого аскорбіновою кислотою утворення продуктів взаємодії з тіобарбітуровою кислотою, що є показником потенційної здатності утворювати кінцеві продукти перекисного окислення, свідчать, що за умов отруєння АФ антиоксидантні властивості мікросомальної фракції печінки знижені: швидкість неферментативного окислення збільшується на 35%, а НАДФН-залежне (ферментативне) утворення малонового диальдегіду (МДА) в ендоплазматичному ретикулумі зростає на 60% порівняно з інтактними тваринами (табл.1). Як "Метавіт", так і метіонін, введені одночасно з АФ, запобігають зростанню інтенсивності індукованого утворення МДА, але, на відміну від досліджуваної композиції, препарат порівняння виявився нездатним підтримувати співвідношення неферментативного окислення до ферментативного на рівні інтактних тварин.

Активація маркерних ферментів цитолізу (АлАТ, АсАТ і ЛФ) в сироватці крові майже в 4, 3 та 2 рази відповідно в порівнянні з інтактними тваринами (табл. 2) свідчить про некрозодистрофічні явища в гепатоцитах в результаті мембранодеструктивної дії як реактивного метаболіту napxІ, так і продуктів перекисного окислення в печінці отруєних щурів. У групі тварин, яким сумісно з анальгетиком вводили досліджувану композицію "Метавіт", активність АлАт, АсАт і ЛФ в сироватці крові зменшилась відповідно на 50, 37 і 22% порівняно з цими показниками в контролі.

Гепатопротекторні властивості "Метавіту" знайшли підтвердження і за показниками масового коефіцієнта печінки, зміни якого, порівняно з нормою, можуть розглядатись як характерні ознаки токсичної дії ксенобіотиків. Нами було виявлено збільшення масового коефіцієнта печінки щурів контрольної групи на 21% порівняно з інтакними тваринами, в той час як у групі тварин, яким сумісно з АФ вводили "Метавіт", він практично не змінився. Метіонін виявився малоефективним.

Таким чином, в результаті проведених досліджень нами встановлено, що токсична дія АФ зумовлена не лише утворенням реактивного метаболіту NAPXІ, здатного взаємодіяти з макромолекулами, в першу чергу центролобулярними зонами печінки, але й активацією процесів вільнорадикального окислення. Композиція "Метавіт", що містить інгредієнти, здатні впливати на процеси біосинтезу глутатіону та антиоксидантний статус організму за умов отруєння АФ, проявила високі гепатопротекторні властивості і може розглядатись як перспективний засіб попередження гепатотоксичної дії АФ.

ЛІТЕРАТУРА
1. Schidt F.V., Rochling F.A., Cacey D.L. Acetaminophen toxicity in an urban county hospital // N. Engl. J. Med. —1997. —V. 337, N16. —P. 1112—1117.
2. A. J. Makin, J. Wendon, R.Williams.A 7-years experience of severe acetaminophen-induced hepatotoxicity (1987—1993) // Gastroenterology. —1995. —V. 109. —P. 1907 —1916.
3. Sherlock S. Nutrition and the alcogolic.//Lancet. —1984. —V. 1. —P. 436—438.
4. Schidt F.V., Lee W.M. Acetaminophen hepatotoxicity: the rest of the story.//Gastroenterology. —1998. —V. 114, N5. —P. 1105—1106.
5. Bernal W., Donaldson P., Underhill J., et all. Tumor necrosis factor genomic polymorphism and outcome of acetaminophen (paracetamol)-induced acute liver failure.//J.Hepatol. —1998. —V. 29, N1. —P. 53—59.
6 Rogers L.K., Moorthy B., Smith C.V. Acetaminophen binds to mouse hepatic and renal DNA at human Therapeutic doses // Chem. Res. Toxicol. —1997. —10, N4. —P. 470—476.
7. Prescott L.F. Paracetamol overdosage. Pharmacological conciderations and clinical management // Drugs. —1983. —V. 25. —P. 290—314.
8. Карузина И.И., Арчаков А.И. Выделение микросомной фракции печени и характеристика окислительных систем // Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н. Ореховича. —М., 1977. —С. 49—62.
9. Sedlak J., Lindsay R. Estimation of total, protein-bound and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent // Analit.Biochem. —1968. —V. 25, N1. —P. 192—205.
10. Babior B.M., Kinner R.S., Creatte J.F.// J. Clin. Invest. —1973. —V. 52. —P. 741—744.
11. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. и др. Определение активности каталазы // Лабораторное дело. —1988. —N 1. —С. 16—19.
12. Романова Л.А., Стальная И.Д. Современные методы в биохимии. Под ред. Ореховича. —М.,1977. —С. 64—66.
13. Романова Л.А., Стальная И.Д./Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н.Ореховича. —М.,1977. —С. 63—64.
14. Lowry O.Ho., Rosenhbroughch N.J., Farr A.I. et all. Protein measurement with the Folin pheno reagent // J. Biol. Chem. —1951. —V. 193. —P. 265—275.