ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

УДК 637.5:574.2

МЕТОД ЕКОЛОГІЧНОГО МОНІТОРИНГУ ЗБУДНИКА ТУБЕРКУЛЬОЗУ В КРОВІ ТА ХАРЧОВИХ ПРОДУКТАХ

1В.В. Власенко, доктор біол. наук, професор, 1С.А. Колодій, 1В.В. Блащук, 2І.Г. Власенко, кандидат біол. наук, 2М.А. Дзюмак, 3О.П. Лисенко, доктор вет. наук. професор

1Вінницький державний аграрний університет
2Вінницький торговельно-економічний інститут КНТЕУ
3Інститут експериментальної ветеринарії ім. С.Н. Вишелеського Національної академії наук Білорусі


РЕЗЮМЕ. В работе раскрыта взаимосвязь стимулирующей репродуктивной активности возбудителя туберкулеза с радиоактивным облучением и показаны стадии развития патогенных микобактерий в системе крови и пищевых продуктах.

SUMMARY. In this work the intercommunication of stimulant reproduction activity of an exciter of tuberculosis with the radio-active irradiation is exposed and the stages of development of pathogenic micobacteries in the system of blood and foodstuffs are shown.


Забруднення біосфери та ґрунту України радіоактивними елементами внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС змінили умови існування всього живого. У цілому, "екологічно значиме" забруднення території України зареєстровано на площі близько 130 тис. км2, або до 20% території країни. Перевищення гранично допустимих рівнів забруднення радіонуклідами екосистеми є небезпечним як для тварин, так і людей [1, 2].

Ситуація із здоров'ям населення України набуває загрозливого стану, загострилась і епідеміологічна ситуація з туберкульозу.

Щороку в Україні виявляється 30–40 тис. хворих на туберкульоз, загальна кількість тих, хто перебуває під наглядом лікувально-профілактичних закладів, становить близько 700 тис. осіб, у т.ч. хворих на активні форми туберкульозу — 140 тисяч. За період з 1990 по 2005 рік захворюваність на туберкульоз органів дихання зросла в 2,4 раза [3].

В 1995 році рішенням ВООЗ в нашій країні було оголошено про епідемію туберкульозу. Слід зазначити, що від цього захворювання щорічно в Україні помирає 10–12 тис. людей. Завдяки цій же хворобі вибраковуються тисячами тонн м'ясо та м'ясопродукти.

Відомо, що для багатьох антропозоонозних захворювань існує біологічний ланцюг "тварина — м'ясопродукти — людина", тобто в разі недостатнього контролю продукти харчування тваринного походження, уражені збудником туберкульозу, можуть передавати збудника (інфекцію) людям. Особливо критична ситуація склалася з оцінкою якості м'яса від тубінфікованих тварин на територіях, забруднених радіонуклідами. Для визначення захворювання тварин на туберкульоз проводять туберкулінодіагностику (туберкулінізацію). Як відомо, туберкулін є алергеном, який виготовляють з високовірулентного (патогенного) штаму збудника туберкульозу. За повідомленням фахівців ветеринарної медицини Ю. Колоса (кандидата вет. наук), О. Якубчак та В. Хоменка (доктори вет. наук, професори), М. Зелінського (головного спеціаліста Держдепартаменту вет. медицини), а також В. Титаренко (заступника директора Держптаховетцентра, м. Київ) та В. Стець (в.о. директора — в статті не зазначеного якого підприємства) цитую: "Туберкулін є алергеном, тобто при потраплянні у сенсибілізований організм викликає певну алергічну реакцію. Щоб вона була специфічною, в алергені (туберкуліні) повинні бути частки клітини збудника туберкульозу. Крім того, в даному препараті можуть бути фільтрувальні форми мікобактерій. Для того, щоб вони не розвивалися і не переходили у вегетативні форми, до препарату додають консерванти (фенол, гліцерин тощо). Отже, такий препарат є специфічним алергеном. Якщо вивільнити його від фільтрувальних форм мікобактерій та залишків розпаду клітин, то він втратить свою специфічність і буде непридатним до використання. Природно, що нейтралізувавши консервант та провівши посіви на спеціальні високочутливі середовища — ВКГ зі стимулятором росту чи інше специфічне і високочутливе — можна досягти реверсії фільтрувальних форм у вегетативну форму мікобактерій.

Треба зазначити, що незначна кількість фільтрувальних часток, яка може потрапити з туберкуліном в організм тварини, не в змозі викликати захворювання тварини" [3]. Отже, як повідомляють автори [3], під час туберкулінодіагностики тварин в організм вводять фільтруючі форми вірулентного збудника туберкульозу. Останні тісно пов'язані із значним радіаційним забрудненням довкілля, що призводить до зниження імунітету тварин і, як наслідок — інфікування продуктів харчування.

Існуючі бактеріологічні методи визначення збудника цієї небезпечної хвороби в продуктах харчування досить складні та тривалі. Це заважає оперативному визначенню тубінфікованого м'яса і м'ясопродуктів.

Метою нашої роботи було вивчення впливу малих доз опромінення на репродуктивну активність збудника туберкульозу; підтвердження чи виключення наявності фільтруючих форм мікобактерій в туберкуліні ППД для ссавців та можливості інфікування ним продуктів харчування.

В роботі використовували туберкулін ППД для ссавців, який вводили морським свинкам, що пройшли карантин, в кількості 3 мл внутрішньоочеревинно і через місяць цим тваринам проводили евтаназію. Для виявлення інфікованості піддослідних тварин відбирали печінку, селезінку та легені морських свинок, яким попередньо вводили туберкулін РРД для бактеріологічних досліджень. Матеріали обробляли 10% розчином трьохзаміщеного фосфорнокислого натрію. Підготовлений матеріал використовували для постановки біологічної проби, тобто проводили виявлення збудника туберкульозу в органах морських свинок після введення туберкуліну. Для біологічної проби використовували морських свинок вагою не менше 250 г, які пройшли карантин. Фільтрат патоморфологічного матеріалу вводили підшкірно в праву пахову ділянку в кількості 0,5 мл. Ефтаназію тваринам проводили через три місяця після інокуляції матеріалу. Мікробіологічному дослідженню піддавали легеневу тканину, печінку та селезінку морських свинок.

Для виявлення фільтруючих форм (артроспор) збудника туберкульозу використовували бактеріальний фільтр Millpore з діаметром 0,22 мікрона. Для виявлення фільтруючих форм у фільтраті його перевіряли на середовищі ВКГ. До отримання фільтрату додавали стимулятор росту ВКГ, після чого інкубірували в термостаті 24 год. при температурі 37°С. Культуральні і бактеріологічні дослідження проводили згідно Наказу №45 МОЗ України. Для вивчення впливу опромінення малими дозами в роботі використано авірулентний штам M. bovis (БЦЖ). Накопичення бактеріальної маси проводили на живильних середовищах Левенштейна-Ієнсена та Павловського.

Дослідні зразки мікроорганізмів піддавали опроміненню дозами 25–250 Р на g-випромінювачах "Исследователь", а для контролю використовували неопромінені культури. Для електронно-мікроскопічного дослідження препарати готували згідно загальноприйнятої методики. Ультратонкі зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-6 та після контрастування цитратом свинцю вивчали під електронним мікроскопом ЕМВ-100 БР з прискорюючою напругою 75 кВт. Збільшення підбиралось адекватно меті дослідження. В результаті проведенної компютерної та електронної мікроскопії було встановлено, що у фільтраті виявлені артроспори збудника туберкульозу діаметром 0,12–0,15 мкм (рис. 1).

Під час електронної мікроскопії на сагітальному розрізі артроспори виявлені міксамеби, які виходять з артроспори після її дозрівання (рис. 2).

Вони не мають клітинної стінки, тому їх називають молікутами (рис. 3). Деякі автори ототожнюють молікути з l-формами. Але в процесі морфологічних досліджень l-форми ідентифікуються як мікроорганізми, що втратили клітинну стінку, тоді як молікут — це стадія розвитку збудника туберкульозу, яка в процесі подальшого розвитку формує стінку [4].

Встановлено, що інокуляція патологічного матеріалу, який містить фільтруючі форми МБТ (відсутність росту на традиційних поживних середовищах і ріст на середовищі ВКГ), в макроорганізмі морських свинок викликає у більшості тварин (83,7%) розвиток патологічних змін, характерних для туберкульозу. У всіх тварин, які були взяті в дослід, під час посіву патологічного матеріалу на середовище ВКГ отримано ріст культур M. bovis. Таким чином, нами підтверджені повідомлення ряда авторів [3] про наявність збудника туберкульозу в туберкуліні ППД для ссавців Сумської біофабрики класичним методом — "триадою Коха". Контрольні дослідження туберкуліну ППД для ссавців Сумської біофабрики також проводились комісійно ученими Казанської академії ветмедицини. Результати цих досліджень підтверджують наявність в туберкуліні живого збудника туберкульозу.

Результати досліджень опромінених і неопромінених культур авірулентних штамів M. bovis (БЦЖ) свідчать, що мікобактерії мають вигляд коротких або помірнодовгих овоїдних паличок (рис. 4).

Відзначається значний поліморфізм мікобактерій, що залежить від терміну вирощування та середовища культивування. У цитоплазмі помітна зернистість — зерна Муха, більшість яких являють собою коковидні утворення, розташовані, як правило, ближче до полюсів клітин у молодих культурах, по всій довжині палички — в старих (рис. 5).

В препаратах з культур, опромінених дозами 25–250 Р, звертає на себе увагу переважання подовжених палочковидних форм. Помітна бугриста нерівна поверхня мікробних клітин, міжклітинні ретикулярні тяжі. На мікробних клітинах в стадії репродукції можна бачити початок брунькування (рис. 6), що свідчить про тенденцію до інтенсивного розвитку та розмноження опромінених культур.

В препаратах з мікобактерій, опромінених стимулюючими дозами (25–250 Р), мікроструктура мікробних клітин аналогічна контрольним (неопроміненим). Структура клітинної стінки й цитоплазма мікробних клітин лишаються типовими, але кокоподібні утворення (зерна Муха) в клітині можуть утворювати три і більше перетинок, що ділять коковидне утворення на декілька нерівномірних "уламків" (рис. 7). В подальшому роздроблені коковидні утворення (зерна Муха) звільняються від оболонки мікобактерії, яка лізується (рис. 8).

Можна думати, що в основі лізису оболонки мікобактерії лежить радіаційне ураження, а саме утворення вільних радикалів Н+ та ОН (переважно з води), які мають високу біологічну активність. Лізована клітинна стінка в подальшому служить матриксом, в якому "уламки" зерен Муха продовжують подальший розвиток за сприятливих умов (рис. 9).

Уламки, які утворились під час дроблення зерен Муха і звільнились від оболонки мікобактерій, в подальшому в сприятливих умовах утворюють коковидні клітини, які розносяться кров'ю по організму (рис. 10).

Слід зазначити, що в сприятливих умовах з кокоподібних клітин утворюється зерниста паличка, де коковидні утворення (зерна Муха) розташовані, як правило, ближче до полюсів клітин (рис. 11).

Результати досліджень щодо виявлення бактеріологічним методом впливу малих доз радіації на ріст культур мікобактерій, в разі використання контрольного середовища Левенштейна-Йенсена та нового "Влакон", наведені в таблиці 1.

Як видно з табл. 1, результати бактеріологічних досліджень опромінених тест-культур значно швидше проявляли ріст в порівнянні з контрольним на 10–17 діб (на середовищі Левенштейна-Йенсена). В препаратах з мікобактерій, опромінених стимулюючими дозами (25–250 Р), виявлені розсипи коків, ди- і тетракоків; у великій кількості — палички різної величини із зернистістю, а також інші форми червоних кольорів. Мікроструктура мікробних клітин аналогічна контрольним (неопроміненим).

Після посіву досліджуваних проб на середовищі "Влакон" через 2–4 доби з'являлися круглі напівпрозорі дрібні колонії сіро-білих кольорів, іноді з жовтуватим відтінком, що легко знімаються із середовища при приготуванні мазків.

В процесі перегляду мазків з отриманих колоній, що виросли на 2–4 добу, виявлені поліморфні форми: дрібні коки, палички різної величини, прямі й вигнуті, із зернистістю (при фарбуванні за Ціль-Нільсеном — від рожевого до червоно-фіолетових кольорів). Ріст культур з молока інфікованих корів збудником туберкульозу на середовищі "Влакон" був у 100% випадків, а на контрольному середовищі Левенштейна-Йенсена — лише у 10% досліджуваних проб. Під час перегляду мазків культур, вирощених на середовищі "Влакон" протягом 1,5 міс. і пофарбованих за Ціль-Нільсеном, виявлені розсипи коків, ди- і тетракоків, у великій кількості — палички різної величини із зернистістю, а також інші форми червоних кольорів.

Кокоподібні клітини здатні утворювати паличковидні форми (рис. 12).

Отже, під час культивування мікобактерій на новому середовищі "Влакон" підтверджена їхня здатність трансформуватися з овоїдних форм в класичні палички Коха.

Таким чином, результати досліджень показали, що мікроструктура мікобактерій туберкульозу після опромінення низькими (стимулюючими) дозами радіації не порушується, а репродуктивна активність зростає, що відповідає результатам культуральних досліджень.

Раніше нами [5] було показано, що розвиток збудника має певну стадійність. Окремі стадії розвитку проходять у крові, печінці, селезінці та лімфатичних вузлах людей, тварин та птиці, що було використано для розробки нового методу ранньої діагностики туберкульозу. Цей метод дає можливість за 30–40 хв. за допомогою вивчення мазка крові чи лімфатичних вузлів тварин визначити наявність збудника туберкульозу в організмі. В разі необхідності додатково проводиться бактеріологічний посів досліджуваного матеріалу на середовище "ВКГ", на якому через 2–3 доби отримують чисту культуру збудника туберкульозу, в тому числі із крові хворої людини чи тварини.

Метод пройшов апробацію і затверджений для практичного застосування Міністерством охорони здоров'я України у вигляді методичних рекомендацій [6]. Запропонований метод є швидким, високоспецифічним, простим у виконанні, не потребує значних матеріальних та трудових витрат, нешкідливий для людей та безпечний для навколишнього середовища. Впровадження даного методу може стати надійним заходом в боротьбі з поширенням епідемії туберкульозу в Україні і підвищити безпеку м'яса та м'ясопродуктів.

У країнах ЄС значну увагу приділяють недопущенню потрапляння на їх територію тварин, хворих на туберкульоз. Проведення туберкулінізації необов'язкове у країнах — членах ЄС чи регіонах країни — члена ЄС, в яких кількість табунів великої рогатої худоби, неблагополучних щодо туберкульозу, не перевищує 0,2% від загальної кількості, а також щодо тварин, які виходять із стада, офіційно визнаного вільним від туберкульозу. Однак, в разі необхідності, алергічне дослідження (туберкулінізацію) тваринам проводять туберкуліном PPD або HCSM під офіційним наглядом. Кожну партію виготовлених туберкулінів офіційно випробовують на відповідність до специфікацій Європейської фармакопеї. Туберкулін повинен бути стерильним, нетоксичним, активним, специфічним. Тому він має бути вільним від мікроорганізмів, в тому числі і від фільтруючих форм збудника туберкульозу.

Враховуючи, що в 1999 р. смертність наших співвітчизників від туберкульозу на 100 тис. населення становила 8,1, але цей показник значно збільшився в 2005 р. і становив 23,1, то необхідно підвищити вимоги до заходів у боротьбі з поширенням епідемії туберкульозу в Україні. Думається, що необхідно відмовитись від використання біологічного препарату (туберкуліну ППД для ссавців), в якому знаходяться фільтруючі форми збудника туберкульозу, так як ці форми, попадаючи в організм тварин з туберкуліном, розносяться кров'ю і виділяються з молоком корів. Важливо пам'ятати, що туберкульоз надзвичайно небезпечна інфекційна хвороба. За даними авторів [7] людина може заразитись під час вживання зараженого мяса, молока, сметани, масла, кисломолочних продуктів. А тому в ході вивчення біології розвитку збудника туберкульозу, з врахуванням екологічного моніторингу, необхідно використовувати сучасні підходи для оцінки якості та безпеки тубінфікованої тваринницької сировини.

Література
1. Пути миграции искусственных радионуклидов в окружающей среде. Радиоэкология после Чернобыля: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Уорнера и Р. Харрисона. —М.: Мир, 1999. —512 с.
2. Москалев Ю.И. Отдаленные последствия воздействия ионизирующих излучений. —М.: Медицина, 1991. —464 с.
3. Колос Ю., Стець В., Титаренко В., Зелінський М., Якубчак О., Хоменко В. До питання діагностики туберкульозу в тварин // Ветеринарна медицина України. —2006. —№11. —С. 10–12.
4. Власенко В.В., Власенко И.Г., Василенко С.П., Колодій С.А., Лысенко А.П. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза // Вісник морфології. —2006. —№12(1). —С. 46–48.
5. Власенко В.В. Туберкульоз в фокусе проблем современности. —Винница: Наука, 1998. —223 с.
6. Мікробіологічні методи обстеження хворих на туберкульоз: Методичні рекомендації МОЗ (на підставі нових даних про особливості біологічного розвитку M.tuberculosis). —Київ, 2001. —23 с.
7. Бусол В.А., Коваленко Л.В., Ситник В.А., Шевчук В.Н. 125 лет со времени открытия возбудителя туберкулеза. —Киев, 2006. —С. 14.


| Зміст |